تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. الخنازير والتعامل مع الخنازير الصغيرة
- استخدم الخنازير الصغيرة من الذكور والإناث بطريقة منهجية وعشوائية للقضاء على أي عوامل مربكة محتملة قائمة على الجنس وفقا لإرشادات ARRIVE.
ملاحظة: نظرا لأن فترة نمو الدماغ القصوى هي في غضون 3-5 أيام من ولادة الخنازير الصغيرة ، يتم إجراء التجربة فقط مع الخنازير الصغيرة التي يبلغ عمرها 3-5 أيام.
- تأكد من وصول الخنازير الصغيرة إلى الحيز قبل 24 ساعة على الأقل من التجربة للسماح بالتأقلم مع البيئة.
ملاحظه: يوفر الطاقم البيطري المدرب رعاية روتينية للحيوانات. يتم الاحتفاظ بالخنازير الصغيرة في أقفاص يتم الحفاظ عليها بشكل فردي ومراقبتها باستمرار وتتلقى بديلا كاملا للحليب من الناحية التغذوية لمنع نقص السكر في الدم. يتم الاحتفاظ بالخنازير أيضا بدون استبدال الحليب (لا شيء لكل OS) ، لمدة 3 ساعات على الأقل قبل التخدير ويتم تزويدها بالبطانيات والألعاب لضمان مستويات التحفيز الطبيعية. إذا أمكن ، احتفظ بالعديد من الخنازير الصغيرة في نفس القفص للسماح بالتنشئة الاجتماعية.
< p class = "jove_title" >
2. تطوير وتخصيص مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) لدراسات السمية العصبية الناجمة عن التخدير (AIN) في نموذج الخنزير الصغير
ملاحظة: تستخدم هذه التقنية MEAs القائمة على الإنزيم المطلية مسبقا بالإنزيم ومطلية بالكهرباء ب m-phenylenediamine dihydrochloride (mPD). تم تصميم الأقطاب الكهربائية خصيصا بعمود صلب 40 مم وتصنيعها للاستخدام في الخنازير الصغيرة (الشكل 1).
- يرجى الاطلاع على الوصف التفصيلي لإعداد ومعايرة MEA (الشكل 2).
فئة
3. التخدير واستخدام جهاز التجسيم المخصص للخنزير الصغير
- تخدير باستخدام محطة عمل التخدير مع جهاز التنفس الصناعي المناسب وأجهزة المراقبة ، ومراقبة المعلمات الفسيولوجية مثل قياس التأكسج النبضي ، وضغط الدم غير الجراحي ، وتخطيط كهربية القلب ، ودرجة الحرارة طوال التجربة بأكملها كما هو موضح سابقا. تنبيب وتهوية الخنازير وإعطاء تخدير سيفوفلوران عند 1 تركيز سنخي كحد أدنى (MAC) (حوالي 2.5-3٪) لمدة 3.5 ساعة. التأكد من وجود موظفي المختبر المدربين لهذه التجارب. تتم إزالة الفراء الذي يغطي المنطقة الجراحية باستخدام مقصات كهربائية قبل تحضير الجلد.
ملاحظه: يسمح تركيز ومدة التخدير المستخدم للتجربة بمحاكاة المدة الزمنية للتعرض الفعلي للتخدير أثناء العملية الجراحية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سيفوفلوران هو التخدير العام الأكثر استخداما لدى الأطفال ، مما يجعل التحقيق المحيط بسلامته ذا أهمية قصوى.
- قبل وضعه في الإطار التجسيمي ، ابدأ جرعة تحميل الروكورونيوم بمقدار 2.5 مجم / كجم وتسريب 1.5 مجم / كجم / ساعة لمنع حركة أثناء تثبيتها في الإطار.
- ضع الخنزير الصغير في الإطار التجسيمي الخاص بالخنزير الصغير بمجرد تأكيد عمق التخدير الكافي عن طريق قرص إصبع القدم.
- قم بتوفير حشوة كافية داخل الإطار التجسيمي عن طريق وضع الخنزير الصغير على وسادة تسخين الهواء القسري مع حشوة إضافية (على سبيل المثال ، محدد الموضع المميع) لمنع تقرحات الضغط.
- ضع أسنان الفك السفلي العلوي فوق قضيب الأسنان (الشكل 3).
ملاحظه: يجب أن يكون شريط الأسنان عند مستوى كاف لتثبيت الجمجمة بإحكام شديد في مكانها.
- قم بإصلاح وشد قضبان الأذن المخترقة داخل الأذنين ، مع الحرص على التأكد من أن الخنزير الصغير في وضع خط الوسط. ضع الأطراف المدببة للحواجز الجانبية داخل قناة الأذن وأدخل قضبان الأذن بقوة كافية لسماع صوت "الفرقعة" المرتبط باختراق الغشاء الطبلي. قم بتوصيل قضبان الأذن بإحكام بالجمجمة وإدخالها بعمق متساو على كل جانب لمنع حركة الجمجمة أثناء التجربة (الشكل 4 ، اللوحة أ).
ملاحظه: من المهم للغاية الحفاظ على دفء الخنزير الصغير (~ 37.8-38.6 درجة مئوية) ومراقبة درجة الحرارة باستمرار أثناء الإجراء بأكمله للحفاظ على الحرارة الطبيعية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق بطانية و / أو مصباح حراري. تأكد من وضع المصباح الحراري على مسافة مناسبة لتجنب حرق جلد.
- قم بإنشاء شق خط الوسط بطول 4-6 سم على طول الجمجمة مع توخي الحذر لتجنب تسجيل الجمجمة بالمشرط. بمجرد إجراء الشق ، استخدم التراجع اللطيف والتشريح الحاد لرفع فروة الرأس من الجمجمة. افرك الجمجمة برفق باستخدام وسادة شاش لإزالة أي نسيج ضام وفضح خطوط الخياطة (الشكل 4 ، اللوحة ب).
ملاحظه: ليس من الضروري الحفاظ على العقم أثناء تجارب عدم البقاء على قيد الحياة. ومع ذلك ، يجب الحفاظ على العقم أثناء تجارب البقاء على قيد الحياة.
- تعكس فروة الرأس بشكل أكبر ، إذا لزم الأمر ، لكشف منطقة الاهتمام وتحديد الموقع المقصود لبضع القحف (الشكل 5 ، اللوحة أ). استخدم مثقابا جراحيا لإنشاء نافذة حج القحف بحجم 0.25 سم2 تقريبا (قد تكون أكبر أو أصغر اعتمادا على الأهداف التجريبية) تغطي الهيكل محل الاهتمام ، مع توخي الحذر حتى لا تؤذي الجافية أو الدماغ الأساسي (الشكل 5 ، اللوحة ب). استخدم مقصا جراحيا دقيقا لاستئصال الجافية التي تغطي أنسجة المخ (الشكل 5 ، اللوحة C).
- ضع القطب الكهربائي عموديا قدر الإمكان فوق بريجما عن طريق تثبيت الذراع المعدنية لمنصة الرأس إلى المعالج الدقيق للخنزير الصغير التجسيم. اخفض القطب الكهربائي قدر الإمكان دون لمس سطح الجمجمة. سجل إحداثيات البريجما (الشكل 6 ، اللوحة أ).
- تحديد الإحداثيات الأمامية الخلفية والإنسية الجانبية بالإضافة إلى عمق الهيكل ذي الأهمية من حيث صلتها بالبريجما. تحديد الإحداثيات التجسيمية باستخدام أطلس تجسيمي مناسب للأنواع والعمر. في هذه الحالة ، استخدم أطلسا تجسيميا تم تطويره خصيصا للخنازير.
- أعد وضع القطب بحيث يكون له الموقع الأمامي الخلفي والإنسي الجانبي المناسب ، مما يضمن أن كلا من القطب الكهربائي الدقيق والجهاز متعامدان على السطح. ضع القطب المرجعي الزائف تحت فروة الرأس ، مع ضمان ملامسة (الشكل 6 ، اللوحة ب).
- ببطء وبلطف ، اخفض القطب إلى العمق المناسب في الدماغ باستخدام الذراع التجسيمية. بالنسبة للآخر 2 مم ، استخدم محرك هيدروليكي صغير لدفع القطب الكهربائي إلى الموقع الدقيق (الشكل 6 ، اللوحة C).
ملاحظه: يجب أن يغطي موضع القطب الكهربائي نافذة حج القحف. يختلف عمق القطب الكهربائي حسب بنية الدماغ ذات الاهتمام. ليس من الضروري إغلاق الشق عند الانتهاء من جمع البيانات في تجارب عدم البقاء على قيد الحياة.
< p class = "jove_title" >
4. قياس الغلوتامات خارج الخلية تحت تخدير سيفوفلوران
- تأكد من أن الخنزير الصغير يخضع للمراقبة الفسيولوجية المستمرة طوال هذا الإجراء. يتم تخدير الخنازير عن طريق الاستنشاق (عن طريق مخروط الوجه) استعدادا للإجراء.
- بعد زرع MEA ، انتظر 30 دقيقة للسماح للقطب بالوصول إلى خط الأساس لضمان الحصول على القياس الصحيح لمدة 3 ساعات (الشكل 7).
يتم - إعطاء 0.25٪ بوبيفاكائين (1 مل / كغ) تحت الجلد في موقع الجراحة لإدارة الألم بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعطاء البوبرينورفين المستمر تحت الجلد q72h حسب الحاجة.
