إعداد نموذج الفئران لتقييم سلامة المسار البصري باستخدام إعداد الفيزيولوجيا الكهربية

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Nguyen ، C. T. et al. ، التسجيل المتزامن لتخطيط كهربية الشبكية والإمكانات البصرية المستحثة في الفئران المخدرة.J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إعداد نموذج الفئران لدراسة صحة الشبكية وسلامة المسار البصري. يتم توصيل الجهد المستحث البصري ومرجع التصوير الكهربائي والقطب النشط بالجرذ ، متبوعا بمحاذاة المنصة مع الجرذ أمام وعاء Ganzfeld لإضاءة شبكية العين وإغلاق قفص فاراداي لتجنب التداخل الخارجي.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الزرع المسبق لأقطاب الجهد البصري المزمن (VEP)

ملاحظة: إذا تم جمع إشارات مخطط كهربية الشبكية المتزامن (ERG) و VEP ، فيجب زرع جراحيا بأقطاب VEP قبل أسبوع واحد على الأقل من جمع الإشارة.

1. تعقيم المقعد الجراحي قبل التجربة عن طريق التنظيف بالكلورهيكسيدين (0.5٪ في 70٪ إيثانول). الأوتوكلاف جميع المعدات الجراحية قبل الاستخدام. قم بتغطية بستارة جراحية معقمة. تأكد من ارتداء جميع المجربين للأقنعة الجراحية والعباءات والقفازات المعقمة.
2. تحفيز التخدير ب 3 - 3.5٪ إيزوفلوران مع O₂ بمعدل تدفق 3 لتر / دقيقة. الحفاظ على التخدير عند 1.5٪ و 2 لتر / دقيقة طوال الجراحة. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة المخلب.
3. ضع 1٪ كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القرنية لمنع جفاف العينين.
4. حلق مساحة 30 مم × 30 مم فوق الجبهة وخلف العينين وأمام الأذنين.
5. ضع على وسادة حرارية (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتثبيت رأس بإطار تجسيمي.
6. تطهير المنطقة المحلوقة ب 10٪ بوفيدون اليود ثلاث مرات. بالنسبة للمنطقة القريبة من العين ، تجنب استخدام المطهرات التي تحتوي على الكحول ، بما يتفق مع معيار الممارسة الذي وضعته جمعية التقنيين الجراحيين.
7. قم بعمل شق سهمي متوسط على الرأس بمشرط ومن هذا المكوس دائرة قطرها ~ 20 مم من الأنسجة الجلدية لفضح عظم الجمجمة.
8. قم بإزالة السمحاق الأساسي عن طريق الكشط والتجفيف بالشاش لكشف خيوط الجمجمة الإكليلية والسهمية.
9. باستخدام نتوءات الأسنان المتصلة بالمثقاب ، قم بحفر فتحتين (قطر 0.7 مم ، عمق ~ 1 مم) من خلال الجمجمة على نصفي الكرة الأرضية عند الإحداثيات التجسيمية: 7 مم ذيلية إلى بريجما ، 3 مم جانبي إلى خط الوسط.
10. قم بربط مسامير من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 0.7 مم ، طول 3 مم ، معقمة بالكلورهيكسيدين) في الفتحتين المعدة مسبقا حتى عمق ~ 1 مم (2 مم من المسمار المكشوف) للسماح بالتثبيت الثابت. هذا يلامس الجافية دون الإضرار بالأنسجة القشرية الأساسية.
11. تحضير المنطقة الجراحية لملغم الأسنان عن طريق تجفيف عظم الجمجمة بالشاش ، وسحب الجلد المترهل بخرزتين 3-0 عند ~ 4 و 8 الساعة.
12. انشر ملغم الأسنان على الجمجمة المكشوفة لتثبيت الأقطاب الكهربائية اللولبية (مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ الموضحة في الخطوة 1.10) في مكانها. تأكد من بقاء ~ 1.5 مم من البراغي مكشوفة للتسجيل.
13. قم بإزالة خيوط التراجع.
14. حقن 0.5٪ كاربروفين تحت الجلد (5 ملغ/كغ) لتسكين الألم والمحلول الملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪، 1.5 مل) تحت الجلد لاستبدال السوائل.
15. اسمح للحيوانات بالتعافي في أقفاص منفصلة. لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
16. لا تعيد إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما من الجراحة (5 أيام على الأقل).
17. يجب الاستمرار في إعطاء 0.5٪ كاربروفين تحت الجلد للمسكن (5 ملغ/كغ) مرة واحدة يوميا لمدة 4 أيام.
18. سجل ERG و VEP بعد أسبوع واحد من الجراحة.

فئة

2. تسجيل ERG و VEP

1. التحضير لجمع البيانات
   1. استخدم برامج الكمبيوتر لتشغيل التحفيز في وقت واحد والحصول على البيانات وفقا للإعدادات الموصى بها أدناه.
      1. تضخيم الإشارات (ERG: ×1,000 ، VEP: x10,000) مع ضبط الكسب داخليا بواسطة مضخم مسبق معزول ومضخم للصوت ، ومع مطابقة كلتا العينين للمقاومة.
      2. اضبط معدل أخذ العينات ل ERG على 4 كيلو هرتز على نافذة تسجيل 650 مللي ثانية (2,560 نقطة) ، للقيام بذلك ، انقر فوق علامة التبويب الخاصة ب "القاعدة الزمنية" في برنامج الحصول على البيانات (للحصول على اسم البرنامج وإصداره ، انظر جدول المواد) ، وحدد "2,560" للعينات ، و "500 مللي ثانية" للوقت الذي سيعيد نافذة تسجيل 650 مللي ثانية.
         1. استخدم نفس الطريقة لتعيين معدل أخذ العينات ل VEP إلى 10 كيلو هرتز خلال فترة 250 مللي ثانية. اسمح بخط أساس مسبق للتحفيز 10 مللي ثانية لكل من تسجيلات ERG و VEP. للقيام بذلك ، انقر فوق علامة التبويب "الإعداد" ؛ حدد "المحفز" لإظهار نافذة حوار جديدة ؛ في تلك النافذة ، حدد "نبض" من القائمة المنسدلة ل "الوضع" ؛ وقم بتعيين قيمة "التأخير" إلى "10 مللي ثانية".
      3. اضبط تصفية تمرير النطاق ERG على 0.3 - 1,000 هرتز (- 3 ديسيبل). يتم ذلك عن طريق النقر فوق "Bio Amplifier" في برنامج الحصول على البيانات. ثم اضبط قيمة "High Pass" على "0.3 هرتز" ، وقيمة "التمرير المنخفض" إلى "1 كيلو هرتز".
      4. باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه في 2.1.1.3 ، اضبط إعدادات تمرير النطاق VEP على 0.1 - 100 هرتز (- 3 ديسيبل) على النحو الموصى به من قبل الجمعية الدولية للفيزيولوجيا الكهربية السريرية للرؤية (ISCEV) لتسجيلات VEP البشرية.

فئة

2. تحضير القطب الكهربائي

1. قم بعمل أقطاب ERG النشطة / غير النشطة و VEP النشطة / غير النشطة حسب الطلب عن طريق ربط سلك فضي أو مشبك تمساح بسلك قطب كهربائي ، على التوالي. الحصول تجاريا على القطب الأرضي.
2. بالنسبة للأقطاب الكهربائية الأربعة المصنوعة حسب الطلب ، قم بقص الطرف الذكري من امتداد الرصاص القطب. قم بإزالة 1 سم من طلاء عازل البولي تترافلورو إيثيلين الخارجي بشفرة مشرط لضمان عدم تلف السلك الداخلي.
3. قم بتصميم أقطاب ERG غير النشطة مسبقا عن طريق قطع سلك فضي بطول 70 مم (سمك 0.3 مم) وتشكيل حلقة بقطر ~ 8 مم لتطويق عين الفئران. قم بإعداد دائرة موحدة عن طريق تشكيل الحلقة على طرف ماصة سعة 1 مل.
4. أقطاب VEP غير النشطة قبل الموضة عن طريق قطع الفضة بطول 70 مم وتشكيل قطع ناقص ~ 8 مم بقطر طولي لتثبيته على قواطع الفئران.
5. قم بتصميم الأقطاب الكهربائية النشطة ERG مسبقا عن طريق قطع سلك فضي بطول 30 مم وتشكيل حلقة صغيرة للاتصال برفق بقرنية الفئران (~ 1-2 مم في القطر)
6. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بإحكام (2 ERG نشط ، 2 ERG غير نشط ، 1 VEP غير نشط) بسلك القطب الكهربائي عن طريق ربط الفضة بالسلك الداخلي المكشوف.
7. اعزل المعدن المكشوف الزائد بشريط لاصق لتقليل القطع الأثرية الكهروضوئية.
8. على أقطاب ERG غير النشطة ، قم بلصق قطعة صغيرة من قفل الخطاف والحلقة (~ 5 مم × 20 مم) بالشريط اللاصق لتمكين التثبيت الثابت بحزام عنق القوارض.
9. قم بتوصيل مشبك التمساح بالسلك الداخلي لأسلاك القطب الكهربائي لعمل أقطاب VEP النشطة.
10. قبل التسجيلات ، قم بطلاء الأسطح المكشوفة للأسلاك الفضية (أي الحلقة غير النشطة والطرف النشط) بالكلوريد باستخدام مصدر تيار مستمر 9 فولت لمدة 20 ثانية لتحسين توصيل الإشارة.
    1. للقيام بذلك ، اغمر الطرف الفضي لسلك القطب الكهربائي ERG (الذي يعمل كأنود للخلية الأولية) في محلول ملحي عادي ؛ وقم بتوصيل الطرف الآخر من سلك القطب هذا بالطرف الموجب لبطارية 9 فولت.
    2. قم بتوصيل سلك آخر (الكاثود) بالطرف السالب للبطارية ، واغمر الطرف الآخر في محلول ملحي أيضا. افصل بعد 20 ثانية ولاحظ الطرف الفضي لسلك قطب ERG ليتم طلاؤه بالتساوي باللون الأبيض.
       ملاحظة: قم بإعداد أقطاب كهربائية جديدة من ERG لكل جلسة تجريبية (~ حتى 8 ساعات) لضمان سالكية طلاء الكلوريد.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير

قم
1. بتكييف في الظلام طوال الليل (≥ 8 ساعات) قبل التسجيلات في غرفة ضيقة الضوء. تأكد من أقصى قدر من التكيف مع الظلام عن طريق إطفاء أضواء الغرفة وإغلاق جميع الأبواب والستائر. قلل من تسرب الضوء عن طريق وضع مواد مقاومة للضوء حول تقاطعات الأبواب / النوافذ ووضع شاشات الكمبيوتر خارج الستائر السوداء السميكة.
2. قم بإجراء تحضير في غرفة مظلمة بمساعدة الصمام الثنائي الباعث للضوء الأحمر الخافت (LED ؛ 17.4 شمعة ^{في متر -2} ، λ_{كحد أقصى} = 600 نانومتر) للحفاظ على حساسية القضيب.
3. تخدير الجرذ عن طريق حقن الكيتامين / الزيلازين (60: 5 مجم / كغ) في العضل. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة المخلب.
4. للحفاظ على التخدير ، قم بإعطاء جرعة أخرى من التخدير (50٪ من الجرعة الأولية) بعد 50 دقيقة إذا لزم الأمر.
5. للتخدير الموضعي الإضافي ، ضع قطرة واحدة من 0.5٪ بروكسي ميتاكائين على كل عين ، وقم بغش السوائل الزائدة.
6. لتوسيع حدقة العين ، ضع قطرة واحدة من 0.5٪ تروبيكاميد على كل عين ، ثم جفف السوائل الزائدة.

فئة

4. تحديد موضع قطب ERG و VEP

1. ضع على منصة ERG أمام وعاء Ganzfeld الموجود في قفص فاراداي. تجنب استخدام وسادة التدفئة الكهربائية ، حيث يمكن أن تدخل ضوضاء كهربائية في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.
   ملاحظة: المنصة متصلة بمنصة مياه ساخنة متداولة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
2. قم بتأمين على المنصة بشريط من قفل الخطاف والحلقة الموضوعة بإحكام ولكن ليس بإحكام حول مؤخرة العنق.
3. اربط قطب VEP غير النشط حول القواطع السفلية للفأر المخدر.
4. ضع أقطاب ERG غير النشطة عن طريق تطويق الحلقة الصلبة بشكل غير جراحي حول خط الاستواء للعين. قم بتثبيت ذلك عن طريق توصيل أقطاب كهربائية بشريط التثبيت المتصل بالخطاف والحلقة حول مؤخرة العنق. كرر للعين المقابلة.
5. اربط أقطاب VEP النشطة عن طريق ربط مشابك التمساح بمسامير من الفولاذ المقاوم للصدأ مزروعة مسبقا على الجمجمة.
6. ضع قطرة صغيرة من 1٪ كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القرنية قبل وضع القطب النشط ERG لتحسين جودة الإشارة.
   ملاحظة: يساعد سائل الفسكوز أيضا في الحفاظ على ترطيب القرنية طوال فترة التجربة لتقليل تكوين إعتام عدسة العين من نوع الجفاف في القوارض.
7. ضع قطرة صغيرة من 1٪ كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القواطع السفلية لتحسين ملامسة القطب الكهربائي غير النشط VEP وبالتالي جودة الإشارة.
8. ضع الأقطاب الكهربائية النشطة ERG للمس سطح القرنية المركزي برفق باستخدام معالج دقيق متصل بذراع تجسيمي مصمم خصيصا.
9. أدخل 2-5 مم من قطب الإبرة الأرضية (الفولاذ المقاوم للصدأ) تحت الجلد في الذيل.
10. إذا لزم الأمر، جفف أي سائل زائد من الجفن السفلي قبل التسجيل لتحسين جودة الإشارة.
11. حرك المنصة بالقرب من وعاء Ganzfeld لضمان محاذاة عيون مع فتحة الوعاء لتمكين الإضاءة المتساوية لشبكية العين (انظر الخطوة 2.4.1).
12. أغلق قفص فاراداي لتقليل الضوضاء الدخيلة.

Materials