إحداث الدوالي المحورية مع حافز ميكانيكي دقيق على الخلايا العصبية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Servello، D.، et al. نظام ميكانيكي ميكروبيولوجي لدراسة تكوين الدوالي والتعافي في محاور الخلايا العصبية المركزية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تحريض الدوالي المحورية عن طريق تطبيق التحفيز الميكانيكي الدقيق على الخلايا العصبية. يتكون النظام من ماصة دقيقة متصلة بحقنة تحتوي على عازلة عبر الأنابيب. باستخدام معالج دقيق ، يتم وضع الماصة الدقيقة فوق الخلايا العصبية. ثم يتم تطبيق ضغط السوائل للحث على الدوالي في المحاور.

البروتوكول

1. إعداد جهاز ماصة النفخ

ملاحظة: هناك خمسة مكونات أساسية لهذا الإعداد: الماصة الزجاجية ، والأنبوب ، والحقنة ، ومعالج الدقيق ، والمخزن المؤقت (هانك) الجدول 1. يمكن استخدام أي مخزن مؤقت يحتوي على تركيزات ملح ذات صلة من الناحية الفسيولوجية في هذا الإعداد.

1. اسحب ماصة البورسليكات بحيث يكون لها طرف فتح بقطر 45 ميكرومتر تقريبا باستخدام مجتذب ماصة دقيقة والمواصفات الواردة في الجدول 2.
   ملاحظة: وجد أن 45 ميكرومتر هو حجم مناسب لقطر فتحة الماصة في ظل الظروف التجريبية. يجب ألا تؤثر الاختلافات الطفيفة في حجم الفتحة بشكل كبير على النتائج. من المهم ملاحظة أن المغادرات الأكبر من هذا الرقم يجب أن تظل تعمل لتحريض الدوالي عن طريق ضبط ارتفاع المحقنة المرتبطة بالماصة عبر الأنبوب، ولكن هذا سيتطلب إعادة معايرة قيمة الضغط.
2. أدخل الطرف غير المسحوب للماصة في أنبوب مطاطي رفيع.
   ملاحظه: يجب أن يكون جدار الأنبوب رقيقا وصلبا لتقليل مقاومة السوائل ، مما يضمن أن ارتفاع المحقنة يتناسب طرديا مع ضغط السائل المتدفق عبر الماصة بمقاومة ضئيلة. يجب ألا يزيد طول الأنبوب عن حوالي 0.6 متر لتقليل المقاومة.
3. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بحقنة بلاستيكية سعة 10 مل من خلال موصل بصمام قابل للدوران.
   ملاحظه: يجب تثبيت المحقنة البلاستيكية على ارتفاع ثابت وقابل للقياس لضمان قياس دقيق للضغط المفترض المتدفق من الماصة. تم استخدام ارتفاع 190 مم لأن هذا يوفر الحد الأدنى من الضغط ولكنه يحفز الدوالي بشكل موثوق في المحاور. يمكن أيضا استخدام قيم ارتفاع أخرى إذا تسبب الضغط في انفصال الخلايا عن سطح الغطاء. يوصى باستخدام نفس الإعداد طوال التجربة.
4. أدخل الماصة في الجزء العلوي اللولبي للمناور الدقيق لتثبيت الماصة في مكانها. قم بربط المسمار المعدني ذو السقف المسطح المتصل بذراع المعالج الدقيق بحيث يحمل الطرف غير المسحوب للماصة فوق مكان توصيل الأنبوب المطاطي مباشرة. قم بزاوية الماصة بزاوية 45 درجة مع سطح الغطاء المحتوي على الخلايا العصبية. ملاحظة: يجب إنشاء المرافعة الدقيقة بحيث يمكن حمل الماصة دون تقييد الأنابيب المطاطية. يجب أن يسمح المعالج الدقيق بحركة الماصة في اتجاهات x و y و z لوضعها بدقة في نطاق الخلايا. يتم توفير رسم وصورة للجهاز أدناه (الشكل 1).
5. قم بتشغيل مرشح التألق ، وافتح الفتحة ، وتأكد من رؤية بقعة الفلورسنت قادمة من خلال الهدف. باستخدام المعالج الدقيق، حرك الماصة إلى موضع يصطف الطرف مع بقعة الفلورسنت وقم بخفض الماصة إلى موضع أعلى مباشرة من ارتفاع طبق زراعة الخلية (35 مم × 10 مم). بمجرد أن يصبح في موضعه ، قم بتشغيل الضوء المرسل وإيقاف تشغيل التألق.
6. باستخدام الملقط ، أضف غطاء غطاء واحد (بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى نحو الماصة) من لوحة زراعة الخلية إلى طبق زراعة الخلية الذي يحتوي على حوالي 2 مل من مخزن هانك المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
7. ضع طبق الثقافة الذي يحتوي على الغطاء على المنظار.
8. باستخدام مقبض التركيز الدقيق والهدف 20X ، ركز على مستوى حوالي أربع لفات كاملة فوق الخلايا (حوالي 0.4 مم). استخدم المعالج الدقيق لوضع طرف الماصة بحيث يتم تركيزه وفي الوسط ، الجانب الأيسر من المستوى كما يرى من خلال قطع العين.
   ملاحظه: التشعبات هي نتوءات يجب أن تكون في نفس إطار جسم الخلية الذي نشأت منه. للحث على الدوالي المحورية ، يجب على المرء أن يتبع إسقاطات أطول من جسم الخلية إلى المحاور الإنسية والبعيدة.

< p class = "jove_title" >2. معايرة ضغط الماصة باستخدام نظام غشاء قابل للتمدد

1. قم بإعداد جهاز ماصة النفخ بنفس المعلمات الموضحة أعلاه بالضبط على نظام يحتوي على غشاء سيليكون دقيق الصنع (قطره 500 ميكرومتر وسمك 50 ميكرومتر) وتركيز المجهر على سطح الغشاء.
   ملاحظه: تم تصميم هذا النظام لقياس قيم الضغط الصغيرة ، وقد تم نشر شرح للنظام من قبل. يجب إجراء هذا القياس مرة واحدة فقط لتجارب النفخ إذا تم استخدام نفس إعداد النفخ بالضبط.
2. ركز المجهر على مصفوفات النقاط الدقيقة (قطرها 4 ميكرومتر ومسافة 10 ميكرومتر ، كما تم قياسها بين المراكز). أدر الصمام الحابس واترك السائل يتدفق خارج الماصة. افحص انحراف الغشاء استجابة لضغط السائل باستخدام مجهر متحد البؤر.
3. استخدم نموذجا خطيا لتحديد الضغط المقابل المرتبط بانحراف الغشاء.
   ملاحظه: بينما وجدت دراسة حديثة أنه تم الحصول على انحراف w = -3.143 ± 0.69 ميكرومتر لارتفاع المحقنة 190 مم ، فإن هذا أنتج ضغطا قدره 0.25 ± 0.06 نانوتن / ميكرومتر² من إعداد الماصة الحالي ، والذي يقع ضمن النطاق الفسيولوجي والمرضي ، على الرغم من أن ارتفاع المحقنة ليس المحدد الوحيد. تؤثر عوامل أخرى على قيمة الضغط الدقيقة على الخلايا العصبية أيضا ، بما في ذلك فتح الماصة ، وتحديد موضع (المسافة والزاوية) لطرف الماصة بالنسبة للخلايا ، وحتى مرونة الأنبوب.

< p class = "jove_title" >3. النفخ للحث على الدوالي

1. بمجرد أن تصبح الماصة في موضعها ، ركز المجهر على مستوى يحتوي على منطقة اهتمام. ضع الخلايا والعمليات في النصف الأيسر من مجال التصوير (الذي يراه الالتقاط المباشر للكاميرا) داخل منطقة النفخ ، بينما يكون النصف الأيمن خارج منطقة النفخ.
   ملاحظه: نظرا للنمو الواسع للمحاور والتشعبات في الخلايا العصبية ، فمن غير المحتمل أن تكون جميع عمليات الخلايا العصبية داخل نفس منطقة النفخ. هذه في الواقع إحدى ميزات هذا النظام ، والتي تسمح بفحص التأثير المحلي للنفخ. هناك نوعان من النفخ يمكن استخدامهما للحث على الدوالي: النفخ طويل الأمد والنفخ النبضي.
2. النفخ
   1. نفخ طويل الأمد
      1. ضع المحقنة في الارتفاع ، 190 مم فوق الغطاء الذي يحتوي على الخلايا العصبية المستنبتة. ابدأ التصوير بفاصل زمني لمنطقة الاهتمام مع وقت تعرض محسن يكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية الواضحة. التقط ما لا يقل عن 15 إطارا بفاصل زمني قدره 2 ثانية (إجمالي 30 ثانية) كخط أساس. يمكن تعديل الفاصل الزمني بناء على التجربة. في الإطار 16 ، افتح صمام الإيقاف القابل للدوران للحقنة واترك السائل يتدفق لمدة 75 إطارا (150 ثانية). عند الإطار 75 ، قم بإيقاف تشغيل الصمام حتى يتوقف تدفق السوائل. إيقاف التقاط الفيديو.
         ملاحظة: يجب أن يؤدي هذا إلى حدوث دوالي محورية في الخلايا العصبية 7-9 DIV في غضون 5-10 ثوان ، بينما تستغرق الخلايا العصبية القديمة وقتا أطول لتكوين الدوالي.
   2. نبض (مدة 2 ثانية) نفخ
      1. ضع المحقنة على الارتفاع المناسب (190 مم). ابدأ التصوير بفاصل زمني والتقط ما لا يقل عن 15 إطارا (30 ثانية) بفاصل زمني قدره 2 ثانية. في الإطار 16 ، افتح صمام المحقنة واترك السائل يتدفق ، ثم أغلق الصمام بعد 2 ثانية. انتظر من 5 إلى 20 ثانية (حسب التردد المراد اختباره) قبل فتح الصمام مرة أخرى. كرر فتح وإغلاق الصمام لإنشاء نبضات سائلة ، واستمر لمدة إجمالية تتراوح من 150 إلى 300 ثانية. استمر في التصوير بفاصل زمني لمدة 20 دقيقة لالتقاط مرحلة الاسترداد.
         ملاحظه: عندما يكون الفاصل الزمني أطول من 10 ثوان ، فإن النبضات تسبب دوالية أقل بشكل كبير. في فاصل زمني 20 ثانية ، لا يمكن إحداث دوالي بواسطة النبضات. للحصول على تكوين دوالي موثوق ومتسق ، ينصح بأن يكون ارتفاع المحقنة حوالي 190 مم. لا ينبغي رفع ارتفاع المحقنة وضغط السوائل إلى النقطة التي تبدأ فيها الخلايا في الانفصال عن سطح الغطاء.
3. قبل يوم من الاستخدام ، قم بتنظيف الإعداد (الماصة والأنابيب والحقنة) عن طريق تدفق حوالي 10 مل 70٪ إيثانول من خلال الإعداد. بعد غسل الإيثانول ، قم بتدفق 10 مل من مخزن هانك المؤقت (أو المخزن المؤقت المطلوب) من خلال الإعداد لتجهيز النظام لاستخدام ذلك اليوم. بعد الانتهاء من التجارب لهذا اليوم ، قم بتنظيف الإعداد كما هو موضح سابقا بالإيثانول لمنع نمو الملوثات بين عشية وضحاها.

الجدول 1: وصفة هانك العازلة. تقوم هذه الوصفة بإعداد المخزن المؤقت المستخدم في بروتوكول النفخ وأثناء تصوير الخلايا الحية.

هانك العازلة (مرشح ، درجة الحموضة = 7.4 ، يحفظ عند 4 درجات مئوية 150 ملم كلوريد الصوديوم 4 مللي كيه سي إل 1.2 ملي كلوريد المغنيسيوم 2 1 ملي متر CaCl2 10 ملغم/مل د-الجلوكوز 20 ملم هيبس

الجدول 2: معلمات سحب الماصة. يوفر المعلمات المراد ضبطها على مجتذب الماصة للحصول على فتحة يبلغ قطرها حوالي 45 ميكرومتر.

معلمات سحب الماصة حرارة سحب السرعه تأخر ضغط منحدر 501 ريال 0 15 1 500 جنيه 530 ريال

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي وصورة لجهاز النفخ. (أ) صور توضح الإعداد العام للمجهر. (ب) جهاز النفخ الذي يظهر الماصة الزجاجية التي يحملها المعالج الدقيق والمتصلة بالأنبوب المطاطي. (ج) صور تباين الطور مع التركيز على مستوى الخلايا العصبية الأولية للحصين التي تظهر ظل الماصة في أسفل اليمين. (د) يركز المستوى خارج الخلية على طرف الماصة المنتفخة. (ه) تخطيطي للمسافات والضغوط المحسوبة لإحداث الدوالي. شريط المقياس...

المواد