إنشاء تكوين مشبك جهد خلية كاملة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في شرائح الدماغ

الملخص

المصدر: Sunstrum ، J. K. ، وآخرون. تقييم التعددية المشبكية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية بأكملها. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو وضع ماصة دقيقة مدببة بالقرب من شرائح الدماغ، لتشكيل ختم بخلية عصبية. يكسر الشفط غشاء الخلية ، وبالتالي يخلق مشبك رقعة للخلية بأكملها يتيح القياسات الحالية لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحلول

1. محلول التقطيع
   1. راجع الجدول 1 لمعرفة تكوين محلول التقطيع.
   2. قم بإعداد محلول مخزون 20x مسبقا وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. للحصول على محلول التقطيع 1x ، قم بإذابة NaHCO₃ والجلوكوز والسكروز في ddH₂O وأضف مخزون 20x. تأكد من أن الأسمولية تتراوح بين 315 و 320 مللي أسم وقم بتخزين المحلول لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.
   4. املأ كوبتين ب 100 مل من محلول التقطيع وقم بتغطيتهما بالبارافيلم قم بتبريد المحلول في الفريزر حتى يتجمد جزئيا (حوالي 20 دقيقة في فريزر -80 درجة مئوية). باستخدام أنبوب تشتت الغاز ، قم بفقاعة كلا أكواب محلول التقطيع بنسبة 95٪ O2 / 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة على الجليد.
2. aCSF (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي) ، لاستعادة الشرائح وصيانتها
   1. راجع الجدول 1 للاطلاع على تكوين aCSF.
   2. قم بإعداد محلول مخزون 20x مسبقا وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. للحصول على 1x aCSF ، قم بإذابة NaHCO3 والجلوكوز في ddH2O وأضف مخزون 20x. تأكد من أن الأسمولية تتراوح بين 298-300 مللي أسم. استخدم المحلول في غضون 1 يوم.
3. aCSF (منخفض Ca²⁺ للتسجيل)
   1. راجع الجدول 1 لمعرفة تكوين Ca²⁺ aCSF المنخفض.
   2. قم بإعداد محلول مخزون 20x مسبقا وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. للحصول على 1x منخفض Ca²⁺ aCSF ، قم بإذابة NaHCO3 والجلوكوز في ddH2O وأضف 20x (CaCl2 و MgCl2 خالي من المخزون) و CaCl2 و MgCl2 إلى تركيزات محددة. تأكد من أن الأسمولية بين 298-300. استخدم المحلول في غضون 1 يوم.
4. aCSF (^{2 ريال سعودي +} للتسجيل)
   1. راجع الجدول 1 للحصول على تكوين SR²⁺ aCSF.
   2. قم بإعداد محلول مخزون 20x مسبقا وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. للحصول على 1x Sr²⁺ aCSF ، قم بإذابة NaHCO3 والجلوكوز في ddH2O وأضف 20x (CaCl2 و MgCl2 مجانا) ، SrCl2 و MgCl2 إلى تركيزات محددة. تأكد من أن الأسمولية بين 298-300. استخدم المحلول في غضون 1 يوم.
5. الحل الداخلي
   1. راجع الجدول 1 لمعرفة تكوين المحلول الداخلي القائم على K-gluconate.
   2. لصنع 20 مل من المحلول الداخلي ، أضف 15 مل من الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية إلى أنبوب سعة 50 مل. ثم قم بتنفيذ الخطوات اللاحقة على الجليد.
   3. قم بإعداد المحاليل التالية في وقت مبكر لتركيزات مخزون 1 متر في مياه درجة البيولوجيا الجزيئية. أضف (بالمل): 2.32 كلورين غلوكونات ، 0.24 Na-gluconate ، 0.20 HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك) ، 0.16 كيلو كلوريل ، 0.05 كلفن 2-EGTA (البوتاسيوم إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N ′ ، N ′ - حمض رباعي الأسيتيك) ، 0.04 MgCl2 إلى أنبوب 50 مل.
   4. أضف 100 ميكرولتر من 0.3 M Na₃GTP (ملح الصوديوم Guanosine 5′-ثلاثي الفوسفات)
   5. وزن 44.08 مجم من K2 ATP (ملح ثنائي البوتاسيوم الأدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل وأضف 1 مل من الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية ، ثم أضفه إلى أنبوب 50 مل.
   6. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.4 مع 1 M KOH. تأكد من أن الأسمولية بين 283-289 مللي أسم.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الشريحة

1. إعداد الأدوات
   1. أضف 200 مل من aCSF إلى غرفة الاسترداد (مصنوعة من دورق سعة 250 مل مع 4 آبار وشبكة) وضع غرفة الاسترداد في حمام مائي (35 درجة مئوية).
   2. قم بتغطية الغرفة بغشاء البارافين وقم بفقاعة aCSF باستمرار بنسبة 95٪ O2 / 5٪ CO2 باستخدام أنبوب تشتت زجاجي لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   3. قم بإعداد أدوات التشريح (مشرط ، مقص ناعم بزاوية ، ملقط ، فرشاة رسم دقيقة ، ملعقة بلاستيكية).
   4. املأ حقنة سعة 60 مل بحوالي 15 مل من محلول التقطيع المثلج من الخطوة 1.1.4.
   5. قم بإعداد منصة التشريح عن طريق وضع ورق الترشيح على غطاء لوح البئر.
   6. تحضير حجرة التقطيع بوضعها في صينية الثلج وملء الصينية بالثلج.
   7. قم بإعداد الاهتزاز عن طريق تثبيت شفرة يمكن التخلص منها في حامل الشفرة.
   8. لعمل ماصة نقل ، اكسر طرف ماصة باستور وضع لمبة مطاطية فوق الطرف المكسور.
2. تشريح دماغ الفأر
   1. قم بتخدير في غرفة مشبعة بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران حتى تغيب ردود الفعل الشوكية.
   2. اقطع رأس باستخدام المقصلة وقم بإزالة الدماغ بسرعة.
      1. قم بعمل شق خط الوسط بشفرة مشرط رقم 22 من المنقارية إلى الذيلية.
      2. بشكل جانبي ، قشر فروة الرأس على كل جانب من الرأس.
      3. استخدم مقصا دقيقا لقطع الجمجمة على جانب واحد من الذيلية إلى المنقارية (بما في ذلك جانب العظام الأمامية) ، مع توخي الحذر حتى لا تتلف الدماغ.
      4. استخدم الملقط لرفع قطعة الجمجمة من الدماغ وتبريد الدماغ بسرعة باستخدام 15 مل من محلول التقطيع المثلج باستخدام المحقنة من الخطوة 2.1.4.
      5. ارفع الدماغ من الجمجمة.
      6. ضع الدماغ في إحدى الأكواب المملوءة بمحلول التقطيع المثلج (من الخطوة 1.1.4) فقاعات مع 95٪ O2 / 5٪ CO2.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير شرائح من منطقة ما تحت المهاد للفأر.

1. قم بحظر الدماغ لمنطقة الدماغ المرغوبة وزاوية القطع (على سبيل المثال ، بالنسبة لشرائح ما تحت المهاد الإكليلية ، قم بقص الأنسجة المنقارية إلى chiasm البصري والذيلية إلى الجسر باستخدام شفرة وتأكد من أن الكتلة الذيلية لها سطح مستو عمودي على قاعدة الدماغ).
2. باستخدام قطعة مقطوعة من ورق الترشيح ، التقط الدماغ من الجانب الأمامي وألصق الجانب الخلفي على لوحة التثبيت باستخدام الغراء الفوري.
3. ضع لوحة التثبيت بسرعة في غرفة التقطيع واملأها بمحلول التقطيع من الدورق الثاني في الخطوة 1.1.4.
4. قم بتأمين حجرة التقطيع وصينية الثلج على الاهتزاز.
5. حدد منطقة التقطيع (الأمامية والخلفية للدماغ) وابدأ في تقطيع شرائح إكليلية بسمك 250 ميكرومتر. المعلمات الموصى بها: السرعة 0.10 مم / ثانية ، السعة 2 مم.
6. قم بقص الشرائح بالحجم المناسب لمنطقة الدماغ المطلوبة.
7. استرجع الشرائح عند 35 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة غرفة الاسترداد من حمام التدفئة واترك الشرائح تتعافى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إضافية. احتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة لبقية اليوم واستمر في غلي الحمام باستمرار بنسبة 95٪ O2 / 5٪ CO2.

< p class = "jove_title" >3. مشبك التصحيح للخلية الكاملة

1. اسحب ماصات التصحيح.​
   1. باستخدام المعلمات المقترحة لتسجيل الخلية الكاملة من دليل مجتذب الماصة، اسحب الماصات الرقعة من الزجاج سميك الجدران إلى مقاومة الماصة من 3-5 MΩ.
   2. باستخدام حقنة دقيقة (تجارية أو محلية الصنع) ، املأ طرف الماصة بمحلول داخلي مفلتر. لعمل حقنة صغيرة ، احرق طرف حقنة سعة 1 مل واترك الطرف يسقط ، مما يؤدي إلى إنشاء طرف طويل وناعم.
2. الحصول على تكوين الخلية الكاملة.
   1. ضع ماصة التسجيل فوق الشريحة مباشرة وقم بإزاحة تيار الماصة في وضع مشبك الجهد. ضع ضغطا إيجابيا طفيفا على الماصة وأغلق المحبس.
   2. حدد خلية سليمة ذات غشاء سليم واقترب منها باستخدام الماصة. يجب أن يتسبب الضغط الإيجابي في حدوث اضطراب طفيف في الأنسجة (أي موجة بطيئة في الأنسجة عند الدخول).
   3. استمر ببطء في تقريب الماصة من الخلية باستخدام حركة قطرية حتى تشكل الماصة غمازة صغيرة على سطح الخلية.
   4. حرر قفل الضغط الإيجابي. ستبدأ الخلية في تكوين ختم ، وستزداد المقاومة فوق 1 GΩ. في مشبك الجهد ، أمسك الخلية عند -68 مللي فولت.
   5. اسحب قليلا بعيدا عن الخلية قطريا لإزالة الضغط الزائد من الخلية.
   6. تعويض سعة الماصة السريعة والبطيئة.
   7. قم بتطبيق شفط قصير من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة لاختراق الخلية والحصول على تكوين خلية كاملة.
   8. قم بالتبديل إلى وضع الخلية في نافذة اختبار الغشاء في برنامج الحصول على البيانات وتحليلها للفيزيولوجيا الكهربية (على سبيل المثال ، Clampex).
   9. قبل كل تسجيل لمشبك الجهد ، قم بإجراء اختبار غشاء باستخدام نفس البرنامج وسجل المعلمات ذات الصلة في كتاب المختبر (مقاومة الغشاء ، ومقاومة الوصول ، والسعة).
   10. حافظ على درجة حرارة حمام التسجيل عند 27-30 درجة مئوية ومعدل التدفق عند 1.5-2.0 مل / دقيقة للتجارب اللاحقة.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين الحلول المختلفة.

تركيزات المحلول (ملي مولار) تشريح aCSF العادي منخفض Ca²⁺ aCSF Sr ⁺ aCSF ماصة / داخلية كلوريد الصوديوم 87 126 126 126 - كيه سي إل 2.5 2.5 2.5 2.5 8 كلوريد_{الهواء 2} 0.5 2.5 0.5 - - SrCl₂ - - - 2.5 - مغنكلوريد₂ 7 1.5 2.5 1.5 2 NaH₂PO₄ 1.25 1.25 1.25 1.25 - NaHCO₃ 25 26 26 26 - الجلوكوز 25 10 10 10 - سكروز 75 - - - - ك-غلوكونات - - - - 116 Na-غلوكونات - - - - 12 هيبس - - - - 10 ك 2-EGTA - - - - 1 ك₂ATP - - - - 4 نا₃GTP - - - - 0.3

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حقنة 1 مل دينار بحريني 309659 10 شفرة فيشر العلمي / آخرون 35698 22 شفرة VWR / أخرى 21909-626 22 مرشحات حقنة uM ميليبور 09-719-000 Adson foreceps هارفارد للأدوات 72-8547 مقص حاد بزاوية هارفارد للأدوات 72-8437 كلامبكس الأجهزة الجزيئية المشبك 10 شفرة مزدوجة الحافة VWR 74-0002 ورق الترشيح سيجما / أخرى 1001090 فرشاة الرسم الجميلة فيشر / مختلف 15-183-35 / مختلف أنبوب تشتت الغاز VWR إل جي-8680-120 إيزوفلوران فريسينيوس كابي / آخرون م 60303 غراء كرازي مختلف مختلف تحليل مصغر سينابتوسوفت التحليل المصغر 6 Osmomoter شركة Wescor Inc نموذج 5600 بارافيلم سيغما PM-996 ماصة باستور VWR 14672-200 مقياس الأس الهيدروجيني ميتلر توليدو FE20-ATC لمبة مطاطية VWR 82024-550 مقبض مشرط رقم 3 هارفارد للأدوات 72-8350 مقبض مشرط رقم 4 هارفارد للأدوات 72-8356 شفرة أحادية الحافة VWR 55411-050 قطاعة الاهتزاز لايكا VT1200S نظام تنقية المياه ميليبور Milli-Q الأكاديمي A10 غطاء لوحة البئر فيشر / مختلف 07-201-590 / مختلف CaCl2 2H2O سيغما [ك7902] CdCl2 سيغما 202908 EGTA سيغما E3889 الجلوكوز سيغما جي 5767 هيبس سيغما إتش 3375 K2-ATP سيغما أ 8937 كيه سي إل سيغما ص 9333 ك-غلوكونات سيغما جي 4500 MgCl2 6H2O سيغما M2670 مياه درجة البيولوجيا الجزيئية سيغما W4502-1L Na3GTP سيغما G8877 كلوريد الصوديوم بيوشوب SOD001.1 Na-غلوكونات سيغما S2054 NaH2PO4 سيغما 71504 NaHCO3 سيغما إس 6014 بيكروتوكسين سيغما ص 1675 SrCl سيغما 255521 سكروز بيوشوب SUC507.1