نهج غير جراحي لدراسة الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا العصبية الحركية في أجنة أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Benedetti ، L. ، et al. إمكانات غشاء الخلايا العصبية الحركية للاستشعار الحيوي في أجنة أسماك الزرد الحية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو فحصا غير جراحي لدراسة الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا العصبية الحركية في أجنة الزرد. عند قياس لف الذيل في الأجنة نتيجة لإزالة الاستقطاب التلقائي للخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي ، يتم تطبيق مانع قناة الصوديوم لتقليل تردد اللف. بعد ذلك ، يتم تثبيت الأجنة في الاغاروز ووضعها تحت المجهر الفلوري. تعبر الخلايا العصبية الحركية المعدلة وراثيا عن مستشعر حيوي لاستشعار الجهد مع متبرع وفلوروفور متقبل. يشير الانخفاض في انبعاث الفلوروفور المستقبل إلى انخفاض في إزالة الاستقطاب التلقائي للخلايا العصبية الحركية بسبب مانع قناة الصوديوم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. pHuC_Mermaid توليد البلازميد

< p class = "jove_content" >ملاحظة: حورية البحر عبارة عن مستشعر حيوي تم تطويره عن طريق إقران مجال استشعار الجهد (VSD) لمستشعر الجهد Ciona intestinalis (الآن Ciona robusta) الذي يحتوي على الفوسفاتيز (Ci-VSP) مع شريك نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: monor) ونسخة أحادية من البروتين الفلوري الباعث للبرتقالي Kusabira Orange (mKOk: متقبل). بالنسبة لهذا المستشعر الحيوي ، فإن التغييرات التوافقية في مجال VSD ، الناجمة عن إزالة الاستقطاب الغشائي ، تزيد من قرب البروتينات الفلورية المانحة والمتقبلة ، وبالتالي زيادة نقل الطاقة بينهما (زيادة نسبة FRET). يضمن VSD التوطين الفعال للمستشعر الحيوي في غشاء البلازما. يتم تحقيق التعبير العصبي للمستشعر الحيوي (في الحبل الشوكي ، يمكن اكتشاف الإشارة في كل من الخلايا العصبية الداخلية والخلايا العصبية الحركية) عن طريق استنساخ إطار القراءة المفتوح لحورية البحر (ORF) تحت محفز عموم العصبي لسمك الزرد HuC.

1. تضخيم إطار القراءة المفتوح لحورية البحر (ORF) عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من pCS4 + بلازميد حورية البحر مع Pfu (التدقيق اللغوي) بوليميراز الحمض النووي باستخدام برايمر T3 العالمي وبرايمر حورية البحر SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTTTA) من أجل إدخال موقع تقييد SmaI في المنبع من حورية البحر ORF.​
   1. استخدم خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي: 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي Pfu ، و 7.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحدد 10x ، و 1 ميكرولتر من ثلاثي فوسفات ديوكسي نيوكليوتيد 10 ملي مولار (dNTPs) ، و 2.5 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 0.5 ميكرولتر (50 نانوغرام) من مستحضر البلازميد ، و 1 ميكرولتر من محاليل مخزون 20 ميكرومتر لكل برايمر بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
   2. قم بتسخين خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل لمدة 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، وقم بتجهيزه لمدة 15 ثانية عند 50 درجة مئوية ، واستطاله لمدة 4 دقائق عند 72 درجة مئوية ليصبح المجموع 35 دورة.
2. قم بتنقية منتج PCR الحاد المحدد باستخدام مجموعة تنقية الجل التجارية ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
3. استنساخ جزء الحمض النووي في المتجه الحاد pCMV-SC باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
4. قم بخطي البلازميد الإيجابي لحورية البحر (المسمى pCMV-SC_Mermaid) باستخدام إنزيم تقييد SmaI للإدخال التالي لمحفز HuC.
   1. قم بإعداد تفاعل التقييد على النحو التالي: 0.5 ميكرولتر (10 U) من إنزيم تقييد SmaI ، و 2 ميكرولتر من مجموعة المخزن المؤقت 10x ، و 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. احتضان التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
5. قم بتنقية البلازميد المهضوم باستخدام مجموعة تنقية هلام تجارية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
6. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) محفز HuC (pHuC) ، باستخدام بوليميراز الحمض النووي Pfu DNA والحمض النووي الجيني لأسماك الزرد كقالب ، باستخدام زوج من الاشعال الخاصة ب HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCACCAGACTTGTCAAAGGGTCCA و HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ويمتد على منطقة 3,150 نقطة أساس في المنبع من ATG.
   1. قم بإعداد خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المخطط التالي: 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي Pfu ، و 7.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحدد 10x ، و 1 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTPs ، و 2.5 ميكرولتر من DMSO ، و 200 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، و 1 ميكرولتر من محاليل مخزون 20 ميكرومتر لكل برايمر في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
   2. بعد خطوة أولية مدتها دقيقتان عند 95 درجة مئوية ، قم بتسخين خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل لمدة 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، وقم بتجهيزه لمدة 15 ثانية عند 50 درجة مئوية ، واستطاله لمدة 4 دقائق عند 72 درجة مئوية ليصبح المجموع 35 دورة.
7. قم بتنقية منتج PCR الحاد المحدد باستخدام مجموعة تنقية الجل التجارية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
8. قم بربط كمية متساوية المولار من pCMV-SC_Mermaid المنقى (الخطوة 1.5) والحمض النووي pHuC (الخطوة 1.7) باستخدام 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase و 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحدد 10X في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. احتضان التفاعل لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
9. قم بتحويل حصة من الخلايا المختصة ب 5 ميكرولتر من تفاعل الربط (الخطوة 1.8) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
10. حدد المستنسخة الموجبة ل pHuC (pHuC_Mermaid) مع إدخال المحفز في الاتجاه الصحيح بواسطة الهضم المزدوج Sal I-EcoRV (تم إدخال موقع تقييد SalI في المنبع من جزء المحفز في الخطوة 1.6 ، بينما يتم وضع موقع تقييد EcoRV في اتجاه مجرى منطقة polyadenylation ، PolyA ، من بلازميد pCMV-SC).
    1. قم بإعداد تفاعل التقييد على النحو التالي: 0.5 ميكرولتر (10 U) من كل من إنزيمات تقييد SalI و EcoRV ، و 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت kit10X ، و 1 ميكروغرام من pHuC_Mermaid DNA بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الحقن المجهري للأجنة

1. انقل البيض المخصب الذي تم الحصول عليه من النوع البري (سلالة AB) أو سمك الزرد البالغ Sod1-G93R إلى طبق بتري مقاس 10 مم باستخدام ماصة بلاستيكية.
2. اشطف الأجنة بماء السمك البارد (4 درجات مئوية) وحقنها على الفور في صفار البيض ب 200 بيكوغرام من البلازميد pHuC_Mermaid باستخدام حاقن دقيق (للحصول على وصف شامل ومفصل لإجراء الحقن المجهري).
3. باستخدام ماصة بلاستيكية ، انقل الأجنة إلى طبق بتري واحتضانها في ماء السمك عند 28 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة النمو المرغوبة (20-24 ساعة بعد الإخصاب ، HPF) للتحليلات التالية.

فئة

3. تحليل لف الذيل التلقائي

ملاحظة: قم بتقييم سلوك لف الذيل التلقائي في 20-24 أجنة HPF مع أو بدون عقار ريلوزول.

1. انقل الجنين إلى طبق بتري دائري مقاس 90 مم مملوء بماء السمك يحتوي على 0.2٪ DMSO (مركبة ريلوزول) وقم بفك الكرين يدويا باستخدام ملقطين من صائغي المجوهرات بأطراف حادة. احتضان الجنين لمدة 5 دقائق.
2. اكتشف لف الذيل في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء تسجيل فيديو مدته دقيقة واحدة باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر مجسم. الحصول على سلاسل زمنية بدقة زمنية تبلغ 30 إطارا / ثانية.
3. احسب تواتر لفائف الذيل التلقائية عن طريق حساب عدد الانحناءات (المقابلة والمماثلة) لكل وحدة زمنية.
4. لتقييم تأثير عقار ريلوزول ، استخدم برفق ماصة باستور بلاستيكية لنقل الجنين إلى طبق بتري جديد مقاس 90 مم مملوء بماء السمك يحتوي على 5 ميكرومتر ريلوزول.​
   1. احتضان الجنين لمدة 5 دقائق قبل تسجيل مقطع فيديو مدته دقيقة واحدة وإجراء التحليل السلوكي على النحو الوارد أعلاه.

4. إعداد التصوير لتصور المستشعر الحيوي لحورية البحر في الأجنة الحية: الكشف المتزامن عن إشارات المتبرع والمتلقي

1. قم بتركيب الأجنة 20-24 HPF في 1٪ من الاغاروز ذات نقطة انصهار منخفضة في مياه السمك عند 37 درجة مئوية داخل طبق تصوير ذو قاع زجاجي مقاس 35 مم. توجيه الأجنة على جوانبها. انتظر حتى يتجمد الاغاروز في درجة حرارة الغرفة.
2. انقل طبق التصوير إلى مرحلة البؤر المتحد المقلوب المركب على مجهر مقلوب. تحديد الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن المستشعر الحيوي بهدف 20X (فتحة عددية 0.7 ، NA) عن طريق إثارة mUKG بخط ليزر الأرجون 488 نانومتر وتسجيل انبعاثه بين 495 و 525 نانومتر.
3. لقياس FRET ، قم بإثارة mUKG ، المتبرع لزوج FRET ، بخط الليزر 488 نانومتر. في وقت واحد ، مع ماسح ضوئي رنين يعمل بسرعة 8,000 هرتز في الوضع ثنائي الاتجاه ، التألق المنبعث من المتبرع (بين 495 و 525 نانومتر) والتألق المنبعث من متقبل mKOk (بين 550 و 650 نانومتر ، قناة FRET). إذا كان ذلك متاحا ، استخدم ليزر 473 نانومتر.
   ملاحظه: سيتم تقليل كفاءة الإثارة للمتبرع بشكل طفيف (85٪ بدلا من 93٪ مع 488 نانومتر) ، ولكن سيتم تقليل الإثارة المتقاطعة للمتقبل أيضا (من 17٪ مع 488 نانومتر إلى 9٪ مع خط ليزر 473 نانومتر).
4. لتقليل السمية الضوئية وتبييض الفلوروفور ، قلل من إضاءة العينة عن طريق تقليل قوة خط الليزر (على نافذة مسار الشعاع لبرنامج الاستحواذ).
5. قم بتحسين الإثارة لمطابقة معلمات الكسب والإزاحة التي تم تعيينها في بداية التجربة وتظل ثابتة طوال الجلسة. لتعيين الإزاحة، قم بتغيير لون الصورة إلى قيم الكثافة (باستخدام جدول البحث Q)، وأثناء المسح الضوئي مع إيقاف تشغيل الليزر، قم بتدوير مقبض الإزاحة (الإزاحة الذكية) بحيث تكون شدة وحدات بكسل الخلفية أعلى قليلا من الصفر. باستخدام نفس جدول البحث ، عن طريق تشغيل الليزر أثناء المسح ، قم بتدوير مقبض الكسب (الكسب الذكي) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد ، مع الحرص على تجنب وحدات البكسل المشبعة.
6. باستخدام ثقب مفتوح (وحدتان متجدد الهواء) ، احصل على صور 16 بت لتوفير نطاق ديناميكي كاف للتحليلات الكمية. تجنب المتوسط لزيادة سرعة الاستحواذ وتقليل التبييض الضوئي.
7. في نافذة الحصول على البرامج، حدد حجم حقل صورة 512 × 64 بكسل (حجم البكسل: 605 نانومتر) من القائمة المنسدلة.
8. من نافذة وضع الاستحواذ ، حدد xyt (الفاصل الزمني على مستوى xy واحد) from القائمة المنسدلة وسجل التغييرات في جهد الخلايا العصبية الشوكية للجنين عن طريق الحصول على مستوى xy واحد ، وتعيين معلمات الاستحواذ لتسجيل صورة واحدة كل 30 مللي ثانية لمدة دقيقة واحدة.
9. لتقييم تأثير إعطاء الريلوزول على إزالة الاستقطاب الغشائي في نفس الخلية العصبية ، احصل على مجموعة بيانات جديدة بعد 5 دقائق من إضافة مياه السمك التي تحتوي على 5 ميكرومتر ريلوزول.
10. لتحليل FRET ، استخدم Biosensor_FRET الماكرو ImageJ (التعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية FRET أحادية السلسلة.)
11. قم بتقييم نسبة FRET للغشاء القاعدي لكل خلية عصبية عند t1 ك ((متوسط FRET - خلفية FRET) / (متوسط المتبرع - خلفية المانح)) ، حيث متوسط شدة FRET والمتبرع هو متوسط شدة التألق المحسوبة في نفس منطقة الاهتمام (ROI) المرسومة حول الخلية لكل قناة مكتسبة وخلفية FRET والمانحة هي متوسط شدة التألق المحسوبة في عائد استثمار مجال الرؤية بدون عينة الفلورسنت.
    ملاحظه: يمكن العثور على وصف مفصل خطوة بخطوة لاستخدام المكون الإضافي على موقع www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
12. استخدم برنامج رسم بياني لمقارنة تردد وسعة ومدة إزالة الاستقطاب بين النماذج التجريبية المختلفة. قارن بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن واعتبر القيم المتوسطة مختلفة إحصائيا عندما <0.05 P.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نقطة انصهار منخفضة الاغاروز سيجما ألدريتش أ 9414 DMSO سيجما ألدريتش W387520 ريلوزول سيجما ألدريتش التوصية 116 بوليميراز الحمض النووي Pfu Ultra HQ Agilent Technologies - قسم منتجات ستراتاجين 600389 T3 التمهيدي العالمي سيجما ألدريتش Wizard SV Gel ونظام تنظيف PCR بروميجا أ 9280 برايمر SmaI العالمي يوروفينز نظام ناقلات تعبير الثدييات StrataClone / متجه حاد pCMV-SC Agilent Technologies - قسم منتجات ستراتاجين 240228 سماي نيو إنجلاند بيولابيس R0141S T4 DNA ligase بروميجا م 1801 سالي نيو إنجلاند بيولابيس R0138S إيكوآر في نيو إنجلاند بيولابيس R0195S 35 مم، طبق تصوير ذو قاع زجاجي المرجع نفسه 81151 ملقط سيجما ألدريتش F6521 مجهر مجسمة لايكا مايكروسيستمز M10 F كاميرا رقمية لايكا مايكروسيستمز DFC 310 FX برنامج Leica Application Suite 4.7.1 لايكا مايكروسيستمز مشغل QuickTime ، الإصدار 10.4 تفاح المجهر متحد البؤر (مقلوب) لايكا مايكروسيستمز TCS SP5 حاقن دقيق إيبندورف فيمتوجيت Biosensor_FRET ماكرو ImageJ GraphPad المنشور 6.0c برنامج GraphPad ، Inc