التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لاستجابات الجهد لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية لشبكية العين لمحفزات الضوء

الملخص

المصدر: Juusola، M.، et al. طريقة الفيزيولوجيا الكهربية لتسجيل استجابات الجهد داخل الخلايا لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الداخلية لمحفزات الضوء في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو بروتوكول التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لنشاط المستقبلات الضوئية في عين ذبابة الفاكهة الجامدة ، مما يتيح القياس الدقيق لتغيرات الجهد استجابة لمنبهات الضوء.

البروتوكول

1. التسجيل من المستقبلات الضوئية R1-R6

1. كن مؤرضا دائما عند تشغيل مضخم القطب الكهربائي الدقيق (على سبيل المثال عن طريق لمس السطح المعدني لقفص فاراداي أو طاولة مضادة للاهتزاز) ، لأن هذا يمنع المرء من توصيل شحنة ثابتة عن طريق الخطأ إلى مرحلة الرأس ، مما قد يؤدي إلى تلف الدائرة.
2. قم بإضاءة عمود منصة إعداد الذبابة من الأعلى باستخدام دليلين ضوئيين معقوفين (الشكل 1 أ) (مع مصدر الضوء البارد داخل قفص فاراداي) بحيث يمكن وضع حامل الذبابة على العمود في الموضع المفضل تحت تحكم بصري دقيق.
3. قم بتركيب حامل الذبابة (مع وجود الذبابة فيه!) على عمود منصة تحضير الذبابة. قم بتدوير حامل الذبابة بحيث تكون العين اليسرى للذبابة تواجه المحقق مباشرة (الشكل 1 ب).
4. أدخل القطب المرجعي غير الحاد برفق من خلال أوسيلي الذبابة في كبسولة الرأس باستخدام معالج دقيق خشن صغير أثناء مراقبة المستحضر من خلال المجهر المجسم (الشكل 1 ج). لا تدفع القطب الكهربائي بعمق شديد ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف دماغ الذبابة.
   1. بدلا من ذلك ، أدخل القطب المرجعي في الجزء الخلفي من الصدر. تأكد دائما من أن الذبابة تبدو بصحة جيدة (تحرك قرون الاستشعار الخاص بها) ، وأن عيناها سليمة ، وليست تالفة عن طريق الخطأ. إذا كان المستحضر يبدو أقل من نقي ، فقم بإعداد ذبابة جديدة للتجارب.
5. قم بدفع القطب الكهربائي الدقيق الحاد في العين اليسرى من خلال فتحة صغيرة مغطاة بالفازلين. استخدم تكبيرا عاليا في المجهر المجسم وحرك أدلة الضوء والمستوى البؤري بحيث يصبح موقع طرف القطب واضحا في 3D من خلال أنماط الانعكاس.
   ملاحظة: يوضح الشكل 1D كيف يجب وضع رأس الذبابة (فيما يتعلق بالزاوية التي يدخل عندها القطب الصغير للتسجيل إلى العين) لتسجيلات المستقبلات الضوئية. يعد دفع القطب الكهربائي إلى العين دون كسره أصعب مرحلة في التجربة. إذا أخطأ طرف القطب الكهربائي في الفتحة الصغيرة في العين ، واصطدم بالقرنية ، فعادة ما ينكسر.
6. قم بتشغيل مضخم القطب الكهربائي الدقيق بمجرد أن يكون كلا القطبين بإحكام داخل المستحضر ، في اتصال كهربائي بسوائل جسم الذبابة.
7. قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء البارد (داخل قفص فاراداي) وافصله عن التيار الكهربائي. قم بتوصيل قابسها بالأرض المركزية لتقليل الضوضاء الكهربائية التي تسببها الحلقة الأرضية وتحريك أدلة ضوء عنق الإوزة بعيدا حتى يمكن تحريك نظام ذراع Cardan بحرية حول الذبابة. أطفئ أضواء الغرفة للتأكد من أن تحضير الذبابة الآن في ظلام نسبي.
8. قم بقياس مقاومة قطب التسجيل في العين. استخدم فقط أقطاب التسجيل التي تكون فيها المقاومة 100 - 250 MΩ.
   ملاحظه: يكاد يكون من المستحيل تحقيق تسجيلات عالية الجودة داخل الخلايا بواسطة قطب كهربائي <70 MΩ. إذا كانت المقاومة <80 MΩ ، فمن المحتمل أن يكون طرف القطب مكسورا. في هذه الحالة ، قم بإيقاف تشغيل مكبر الصوت وتغيير قطب التسجيل.
9. اضبط مكبر الصوت على وضع تسجيل المشبك الحالي (CC) أو الجسر. قم بإلغاء أي فرق عشوائي في الجهد بين أقطاب التسجيل والمرجعية ، حيث أن كلاهما يستريح الآن في الفضاء خارج الخلية المترابط كهربائيا ، عن طريق ضبط إزاحة الإشارة (تسجيل الجهد) على الصفر. اتبع تغييرات إزاحة الإشارة باستخدام قراءة عرض مكبر الصوت أو شاشة راسم الذبذبات.
10. انتظر 2-3 دقائق حتى تتكيف عين الذبابة مع الظلام.
11. قم بدفع طرف قطب التسجيل بشكل أعمق في العين بخطوات صغيرة من 0.1 إلى 1 ميكرون. افعل ذلك باستخدام متدرج بيزو ذو المحور x لمعالج دقيق يتم التحكم فيه عن بعد أو عن طريق تدوير مقبض الدقة الدقيقة للمناور اليدوي برفق.
12. حفز عين الذبابة بومضات ضوئية قصيرة (1 - 10 مللي ثانية) أثناء تقدم قطب التسجيل في الأنسجة.
    ملاحظه: إذا تم وضع قطب التسجيل في شبكية العين وتعمل العين بشكل طبيعي ، فإن كل وميض ضوئي سيؤدي إلى انخفاض قصير وصغير في الجهد (0.2 - 5 مللي فولت فرط الاستقطاب) ، يسمى مخطط كهربية الشبكية (ERG). يحدث هذا التغيير في إمكانات المجال للفضاء خارج الخلية بسبب الاستجابة الجماعية لخلايا الشبكية للضوء.

النتائج

الشكل 1. وضع حامل الذبابة والأقطاب الكهربائية للتجارب. (أ-ب) يتم وضع حامل الذبابة على منصة التسجيل التي توفر أيضا التحكم في درجة الحرارة عبر عنصر Peltier (A: منصة مستديرة بيضاء في المنتصف). يتيح ذراع Cardan تحديد الموقع الدقيق لمحفز الضوء على مسافة متساوية (عبر x ، y-turn) حول الذبابة ، مع مصدر الضوء (نهاية حزمة الألياف الضوئية السائلة أو الكوارتز) مباشرة إلى عينها. في العديد من حفاراتنا ، يتم إنشاء ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجهر تكبير ستيريو لإعداد الذبابة أوليمبوس عدسات SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H / 22 قادرة على تكبير ~ 150X مع مسافة عمل طويلة ؛ حامل جبل طاولة فولاذية ثقيلة حسب الطلب المجهر المجهري في الإعداد داخل الخلايا أوليمبوس أوليمبوس SZX7؛ العدسات: WHN30x-H/22 هناك حاجة إلى عدسات 30X لرؤية انعكاسات طرف القطب الكهربائي جيدا عند قيادتها عبر ثقب القرنية الصغير في العين مجهر نيكون نيكون SMZ645 ؛ العدسات: C- W30x / 7 طاولة مضادة للاهتزاز ميليس جريوت مع فتحات مترية M6 على اللوح تحتوي حفاراتنا المخصصة على ثقب كبير محفور من خلال اللوح السميك الذي يسمح بدخول عمود منصة تحضير الذبابة (يضم غرفة تبريد نحاسية مع إلكترونيات) من الأسفل نيوبورت أجهزة المعالجة الدقيقة ناريشيجي ناريشيجي NMN-21 في إعداداتنا داخل الخلايا ، يتم استخدام أنظمة معالجة دقيقة مختلفة لدفع أقطاب تسجيل التشكيل في عين الذبابة. توفر جميع المتلاعبين المدرجين بنجاح تسجيلات مستقرة طويلة الأمد من ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية و LMCs. هكسلي بيرترام محور Huxley xyz مع تحكم يدوي دقيق سينسابكس Sensapex ثلاثي المحور Märzhäuser Märzhäuser DC-3K مع متدرج بيزو إضافي للمحور x ووحدة تحكم MS 314 تقف مغناطيسية أي قاعدة مغناطيسية مع مفتاح تشغيل / إيقاف ستفي بالغرض على سبيل المثال ، لإدارة الكابلات داخل قفص فاراداي حاملات القطب الكهربائي جهاز هارفارد ESP / W-F10N الأسلاك الفضية أدوات الدقة العالمية AGW1510 0.3 - 0.5 مم قطر؛ يحتاج إلى الكلور لحاملي الأقطاب الكهربائية مصدر ضوء الألياف البصرية العديد من الاختلافات ، بما في ذلك أوليمبوس حزم الألياف البصرية تقنية UltraFine لتوصيل محفز ضوء LED لنظام ذراع كاردان. نحن نستخدم أدلة الضوء السائل والكوارتز (تتراوح من الأشعة فوق البنفسجية إلى الأشعة تحت الحمراء) مختبرات ثورن أنبوب التكاتير يطير P80-50P 50 مل سنت. أنبوب PP. ، عبوة من 100 قطعة اقطع الجزء السفلي المخروطي من أنبوب الطرد المركزي البلاستيكي سعة 50 مل وقم بلصق طرف ماصة سعة 1 مل عليه. نظام الاستحواذ الرقمي الصكوك الوطنية مضخم قطب كهربائي واحد للتيار / الجهد المشبك npi SEC-10LX http://www.npielectronic.de/ المنتجات / مكبرات الصوت / ثانية أحادية electrode-clamp/sec-10lx.html أداء متميز! مرحلة الرأس قياسي (+/- 150 نانوأ) ل npi SEC-10LX مصادر إضاءة LED وبرامج التشغيل 2 قناة OptoLED (كيرن ريسيرش المحدودة ، المملكة المتحدة) العديد من أنظمة التحفيز لدينا مبنية داخليا مصممة ذاتيا وبناءت برامج الاستحواذ والتحليل العديد من الشركات للاختيار من بينها Biosyst؛ نظام مكتوب حسب الطلب يعتمد على Matlab للعمل التجريبي والنظري في مختبر Juusola الكمبيوتر الشخصي أو Mac تأكد من أن الكمبيوتر الشخصي أو جهاز Mac متوافق مع نظام وبرامج الحصول على البيانات نظام ذراع كاردان مصممة ذاتيا وبناءت توفير تحديد المواقع بدقة x و y و z لمنبهات الضوء نظام التحكم في درجة الحرارة بلتيير مصممة ذاتيا وبناءت قفص فاراداي ذاتي البناء حماية الضوضاء الكهرومغناطيسية الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات الخيطية القطر الخارجي: 1 مم القطر الداخلي: 0.5 - 0.7 مم الشعيرات الدموية الزجاجية الكوارتز الخيطية القطر الخارجي: 1 مم القطر الداخلي: 0.5 - 0.7 مم مجتذب الماصة شركة سوتر للأدوات نموذج P-2000 ليزر مشتعل / مجتذب ماصة دقيقة براون بالنسبة للأقطاب الكهربائية المرجعية للبورسليكات ، استخدم البرنامج المحدد مسبقا # 11 (أقطاب التصحيح): الحرارة = 350 ؛
خيوط = 4 ؛ السرعة 36 ؛ تأخير
= 200).1.2.1). بالنسبة لأقطاب تسجيل البورسليكات ، استخدم البرنامج المحدد مسبقا # 12 (هذا عادة ما يسحب الأدوات الحادة التقليدية الجيدة لتسجيلات المستقبلات الضوئية): الحرارة = 355 ؛ خيوط = 4 ؛ السرعة 50 ؛ التأخير = 225 ؛ سحب = 150. بالنسبة لتسجيلات LMC ، التي تتطلب أقطاب كهربائية ذات أطراف أدق ، يجب تعديل هذه القيم. لسحب الشعيرات الدموية الكوارتز ، يقترح دليل P-2000 برامج ل
أقطاب كهربائية دقيقة الرؤوس. تعمل المعلمات المحددة مسبقا لهذه البرامج كنقاط انطلاق مفيدة
للتعديلات المنهجية لتوليد أقطاب كهربائية بنجاح اختراق جيد وضوضاء تسجيل منخفضة. محلول رنين خارج الخلية للقطب المرجعي مواد كيميائية من فيشر ساينتفيك 10326390 ، كلوريد الصوديوم 10010310 ، KCl
10147753 ، TES 10161800 ، CaCl2
10159872 ، MgCl2 10000430 ،
سكروز انظر الوصفة في قسم البروتوكول محلول 3 M KCl لملء القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل الخيطي أملاح من فيشر ساينتفيك 10010310 ، KCl الفازلين فاسيلين