مراقبة الإشارات الكهربائية من الخلايا العصبية الواردة في يرقة الزرد المجمدة

الملخص

المصدر: Lunsford ، E. T. ، وآخرون. نشاط الخلايا العصبية الواردة في الخط الجانبي الخلفي أثناء السباحة في أسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تسجيل الإشارات الكهربائية من الخلايا العصبية الواردة في يرقة الزرد المشلولة عن طريق وضع ماصة دقيقة بالقرب من عقدة الخط الجانبي وتشكيل ختم فضفاض لالتقاط الإشارة. يحافظ المحلول خارج الخلية على قابلية الخلايا العصبية أثناء هذه العملية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية

1. اصنع طبق تسجيل ذو قاع من المطاط الصناعي من السيليكون.
   1. قم بتوزيع طبقة رقيقة من مكونات المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون ذاتية الخلط (على سبيل المثال ، Sylgard) في طبق زراعة الأنسجة ذو القاع الزجاجي حتى يتم تسويتها مع حافة بئر ضحل. يكفي حوالي 0.5 مل.
   2. غطي الطبق ويعالج لمدة 48 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
2. اصنع دبابيس تشريح.
   1. باستخدام مصدر طاقة تيار مستمر ، قم بتوفير شحنة سالبة (5 فولت) إلى دورق 100 مل من الحفر (3M KOH) وقم بتوصيل سلك تنجستن (0.002 بوصة ؛ قطر 50.8 ميكرومتر) بالإخراج المشحون إيجابيا.
      أنذر: يجب ألا تتصل الأسلاك السالبة والموجبة ببعضها البعض أثناء هذا الإجراء حيث قد تتعرض لخطر إنتاج شرر ، مما قد يشكل خطر نشوب حريق محتمل.
   2. قم بحفر سلك التنغستن عن طريق غمس الطرف بسرعة وبشكل متكرر في حمام الحفر حتى يضيق الطرف إلى نقطة حادة. تحت المجهر المجسم ، قم بقص السلك حوالي 1 مم من الحافة بشفرة حلاقة ذات حافة مستقيمة. كرر ثلاث مرات أخرى ، ثم أدخل المسامير في طبق التسجيل المعالج باستخدام ملقط دقيق.
3. تحضير أقطاب التسجيل.
   1. باستخدام مجتذب ماصة دقيقة أفقية مع خيوط صندوقية ، اسحب أنبوبا شعريا زجاجيا من زجاج البورسليكات (القطر الداخلي: 0.86 مم ، القطر الخارجي: 1.50 مم) في أقطاب كهربائية برأس قطره 30 ميكرومتر مع تفتق طفيف (الشكل 1 Ai) والتي سيتم استخدامها لتسجيل الخلايا العصبية الواردة من الخط الجانبي الخلفي.
   2. اسحب أنبوبا شعريا إضافيا من زجاج البورسليكات إلى زوج من الأقطاب الكهربائية بأقطار طرف أصغر (1-5 ميكرومتر). أمسك قطبا كهربائيا واحدا في كل يد ، وقم بتشغيل الأطراف برفق عبر بعضها البعض لكسرها بزاوية ~ 30 درجة. باستخدام microforge ، قم بتلميع الطرف المشطوف حتى يصبح ناعما.
4. إنشاء البروتوكول في برامج تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية.
   1. تأكد من توصيل مرحلة الرأس اليمنى بمدخل القناة 1 في الجزء الخلفي من تيار القطب الصغير ومضخم مشبك الجهد لتسجيلات الخلايا العصبية الواردة.
      ملاحظة: تتطلب مواصفات الكمبيوتر لمضخم مشبك التيار والجهد إلى الحد الأدنى معالجا بتردد 1 جيجاهرتز أو أفضل أو Windows XP Pro أو Mac OS X 10.46.6 ومحرك أقراص مضغوطة بذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 512 ميجابايت ومساحة على القرص الصلب تبلغ 500 ميجابايت ومنفذي USB.
   2. افتح برنامج مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر.
   3. اضبط القناة 1 على وضع المشبك الحالي بالنقر فوق الزر IC.
   4. أدخل المعلمة التالية ضمن علامة التبويب I-Clamp 1. الإخراج الأساسي: 100x جهد غشاء التيار المتردد (100,000 مللي فولت / مللي فولت) ، الكسب: 1,000 ، بيسل: 1 كيلو هرتز ، التيار المتردد: 300 هرتز ، النطاق: تجاوز. الإخراج الثانوي: 100x إمكانات غشاء التيار المتردد (100 مللي فولت / مللي فولت) ، الكسب: 1 ، مرشح التمرير المنخفض: 10 هرتز.
   5. احفظ معلمة القناة ك Ch1_Aff.
   6. قم بتثبيت وفتح برنامج الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح.
   7. انقر فوق تكوين وحدد Lab Bench لإعداد الإشارات التناظرية عن طريق إضافة Ch1_Aff إلى قنوات Digitizer (على سبيل المثال ، Analog IN # 0 و Analog IN # 1) المتصلة بواسطة كابل BNC متحد المحور إلى مخرجات Channel 1 Scaled المقابلة لمكبر الصوت. انقر فوق OK.
      ملاحظة: الحد الأدنى لمتطلبات الكمبيوتر للمحول الرقمي هو: معالج 1 جيجاهرتز أو أفضل ، Windows XP Pro أو Mac OS X 10.46.6 ، محرك أقراص مضغوطة 512 ميجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ، 500 ميجابايت مساحة محرك الأقراص الثابتة ، ومنفذي USB.
   8. انقر فوق الحصول على وحدد بروتوكول جديد.
   9. في علامة التبويب الوضع/المعدل، حدد خال من الفجوة؛ ضمن وضع الاستحواذ، اضبط طول الإصدار التجريبي على إما استخدام مساحة القرص المتوفرة (أي التسجيل حتى إيقافه) أو المدة المطلوبة (hh:mm:ss)، ثم اضبط معدل أخذ العينات لكل إشارة (هرتز) على 20,000 لزيادة الدقة.
   10. ضمن علامة التبويب المدخلات، حدد قنوات الدخول التناظرية التي تم تكوينها مسبقا (في الخطوة 1.4.6) وحدد Ch1_Aff للقناة المقابلة.
   11. ضمن علامة التبويب المخرجات، حدد Cmd 0 و Cmd 1 للقناة #0 والقناة #1، على التوالي.
       1. توصيل أمر القناة 1 على مكبر الصوت بالإخراج التناظري 0 على المحول الرقمي عبر كبل BNC متحد المحور.
   12. يمكن أن تظل علامات التبويب المتبقية ضمن الإعدادات الافتراضية. انقر فوق "موافق" واحفظ البروتوكول.

< p class = "jove_title" >2. إعداد الحل

1. تحضير محلول هانك: 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5.4 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.25 ملي سجدية₂HPO₄ ، 0.44 ملي كيلو هيلولار₂PO₄ ، 1.3 ملي كلوريد الكالسيوم₂ ، 1.0 ملي مللي كلوريد_{الصوديوم 4} ، 4.2 ملي هيدروكسيوم₄ ؛ الرقم الهيدروجيني 7.3. خفف إلى 10٪ من محلول هانك عن طريق إضافة الحجم المناسب من الماء منزوع الأيونات إلى المخزون.
2. تحضير المحلول خارج الخلية: 134 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.9 ملي كلوريد كلوريد ، 1.2 ملي كلوريد_{الملزوم 2} ، 2.1 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 10 ملي مولار جلوكوز ، و 10 ملي مولار عازلة هيبس ، درجة الحموضة 7.8 معدلة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. قم بتصفية المحلول خارج الخلية بالفراغ من خلال مرشح بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
3. تحضير α -bongarotoxin: قم بإذابة 1 مجم من α-bungarotoxin المجفف بالتجميد في محلول خارج الخلية سعة 10 مل لإنتاج تخفيف بنسبة 0.1٪.
4. تحضير محلول القتل الرحيم: 50٪ (مجم / لتر) MS-222 مخزن من الدرجة الصيدلانية في محلول هانك بنسبة 10٪.
   تنبيه: α-بنجاروتوكسين هو سم عصبي قوي يشل العضلات عن طريق منع المستقبلات الكولبينية. القفازات مطلوبة ويوصى بحماية العين أثناء التعامل مع الشلل.

< p class = "jove_title" >3. تحضير اليرقات للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية

1. شل حركة يرقات الزرد.
   1. استخدم اليرقات من مجموعة أسماك الزرد المرباة في المختبر (Danio rerio ؛ بعد 4-7 أيام من الإخصاب) ووضعها في محلول الجنين (10٪ محلول هانك) عند 27 درجة مئوية.
   2. باستخدام ماصة نقل ذات رؤوس كبيرة ، انقل اليرقة من السكن إلى طبق بتري صغير (35 مم) وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المحيط.
      ملاحظه: إزالة محلول الجنين يمنع تخفيف الشلل ويزيد من فعاليته. يمكن استخدام زاوية مسح المهام لامتصاص محلول الجنين المتبقي ، ومن الأهمية بمكان عدم ملامسة اليرقات أو تركها معرضة للهواء.
   3. اغمر اليرقات في 10 ميكرولتر من 0.1٪ α-بنجاروتوكسين لمدة 5 دقائق تقريبا < / > ملاحظه: يختلف الوقت اللازم لشل حركة اليرقات بين المستحضرات. يعتمد التحضير الصحي على المراقبة الدقيقة لتدفق الدم السريع المستمر وانخفاض الاستجابات الحركية. يمكن أن يؤدي التعرض المفرط لفترة وجيزة للشلل إلى تدهور بطيء في الصحة العامة للمستحضر ، حتى بعد الغسيل الشامل. من الأفضل تطبيق الغسيل قبل تجميد اليرقة تماما بينما لا تزال تظهر عليها علامات اهتزازات عضلية خفية.
   4. اغسل اليرقة المشلولة بالمحلول خارج الخلية واستحم لمدة 10 دقائق < / > ملاحظه: يسمح الغسل لليرقة بالانتقال من اهتزازات العضلات الدقيقة إلى الشلل الكامل. أيضا ، α-bungarotoxin هو مضاد لمستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتين (nAChR) α9-الوحدة الفرعية ، وهو مكون حاسم لدائرة التغذية المرتدة الداخلية التي يلاحظها هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، فقد ثبت أن هذا التأثير قابل للعكس في خلايا شعر Xenopus وسمك الزرد بعد غسل لمدة 10 دقائق.
2. دبوس السمك في طبق التسجيل.
   ملاحظه: التخدير (على سبيل المثال ، MS-222 ، Tricaine) غير مطلوب أثناء تحضير يرقات الزرد (4-7 dpf) لأنه يتداخل مع صحة. في الواقع ، يتم إعفاء يرقات الزرد من بعض بروتوكولات الفقاريات.
   1. باستخدام ماصة النقل ، انقل اليرقة من حمام المحلول خارج الخلية إلى طبق التسجيل ذو القاع السيليكون. املأ ما تبقى من الطبق بالمحلول خارج الخلية.
   2. تحت المجهر المجسم ، ضع اليرقات برفق باستخدام ملقط رفيع فوق مركز حصيرة السيليكون ، الجانب الجانبي لأعلى ، مع تشغيل الأطراف الأمامية والخلفية للجسم من اليسار إلى اليمين ، على التوالي. ثم أمسك دبوسا محفورا من حصيرة السيليكون باستخدام ملقط رفيع الرؤوس وأدخل الدبوس ، متعامدا إلى السيليكون ، من خلال الحبل الظهري لليرقات مباشرة الظهرية إلى فتحة الشرج. أدخل الدبوس الثاني من خلال الحبل الظهري بالقرب من نهاية الذيل وأدخل الدبوس الثالث من خلال ظهري الحبل الظهري للمثانة الغازية (الشكل 1 ب).
      ملاحظه: أثناء إدخال المسامير ، من المهم استهداف مركز عرض الحبل الظهري لمنع اصطدام تدفق الدم أو إتلاف العضلات المحيطة. الحبل الظهري هو العصب الجانبي الخلفي ، لذلك مع التثبيت المناسب ، لا يتوقع حدوث أي ضرر للخلايا العصبية الحسية للخط الجانبي. أدخلها بعد الاتصال الأول حتى لا تزعج الأنسجة المحيطة. من الناحية المثالية ، يكون قطر الدبوس أقل من نصف عرض الحبل الظهري لضمان الإدخال النظيف. إذا تجاوزت المسامير هذا العرض ، فكرر الخطوة 1.2 حتى يتم الوصول إلى عرض الدبوس المطلوب. إذا تباطأ تدفق الدم بعد التثبيت ، كرر من الخطوة 1.3 فصاعدا مع عينة جديدة.
   3. أدخل الدبوس الرابع من خلال الحويصلة الأذنية مع توفير دوران طفيف نحو الأمام حيث يتم إدخال الدبوس في المغلف (الشكل 1 ب). عند تطبيق دوران طفيف ، راقب الأنسجة بين الكليثروم وحويصلة الأذن للكشف عن مجموعة سوماتا الواردة.
      ملاحظه: الإدخال بزاوية للدبوس الرابع هو ضمان تعرض العقدة الواردة للخط الجانبي الخلفي ، والتي تعيقها الحويصلة الأذنية الكبيرة.

< p class = "jove_title" >4. تسجيل الخلايا العصبية الواردة

1. املأ قطب التسجيل الوارد ب 30 ميكرولتر من المحلول خارج الخلية، وأدخله في حامل ماصة مرحلة الرأس الأيمن (الشكل 1B، C)، وقم بخفضه في محلول الطبق أثناء تطبيق الضغط الإيجابي (1-2 مم زئبق) الناتج عن محول طاقة هوائي.
2. حدد موقع العقدة الواردة الجانبية الخلفية وتعلق عليها بشكل فضفاض.
   1. باستخدام معالج دقيق ، اخفض طرف القطب الوارد حتى يظل في موضعه فوق cleithrum.
   2. قم بزيادة التكبير إلى غمر 40x وحدد موقع تقاطع العصب الجانبي الخلفي و cleithrum. اتبع العصب الجانبي الأمامي من cleithrum إلى حيث تعقيم الألياف العقدة الواردة للخط الجانبي الخلفي ، والتي يمكن تمييزها من خلال المجموعة المنفصلة من سوما (الشكل 1F).
   3. ضع طرف القطب فوق العقدة الواردة وقم بخفض الماصة حتى يلامس الطرف الظهارة. قم بمناورة القطب الكهربائي برفق بحيث يلامس محيط الطرف بالكامل العقدة الواردة.
   4. قم بتطبيق الضغط السلبي (20-50 مم زئبق) باستخدام محول الطاقة الهوائي واحتفظ به.
      ملاحظه: الضغط السلبي المطبق على العقدة الواردة لطيف. يمكن أن تؤدي زيادة الضغط السلبي إلى تحسين الإشارة إلى الضوضاء ، لكن صحة الخلايا العصبية الواردة تنخفض في ظل الشفط العدواني المستمر ، مما يقلل من احتمالية التسجيل الناجح.
3. سجل نشاط الخلايا العصبية الواردة.
   1. يجب توصيل مرحلة الرأس اليسرى بمكبر الصوت ، الذي ينقل الإشارة المضخمة إلى محول رقمي يخرج الإشارة المذكورة في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح ليتم مراقبته على جهاز كمبيوتر مجاور.
   2. في pClamp10 ، انقر فوق الزر "تشغيل" على شريط الأدوات لمراقبة الخلايا العصبية الواردة.
   3. تأكد من أن الخلية بأكملها ، تسجيل رقعة فضفاضة للخلايا العصبية الواردة يتم تحقيقه بمجرد حدوث المسامير تلقائيا ، تقريبا كل 100-200 مللي ثانية (الشكل 1E).
   4. تدريجيا ، قم بزيادة ضغط القطب الكهربائي لتسجيل الخلايا العصبية الواردة مرة أخرى إلى الغلاف الجوي (0 مم زئبق) واستمر في الفترة المتبقية من التسجيل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المتزامن للخط الخلفي الجانبي الخلفي ونشاط الجذر الحركي البطني. (أ). مثال على أقطاب تسجيل التصحيح السائبة (i) وجذر المحرك البطني (ii). تمثل قضبان المقياس 50 ميكرومتر. (ب) يرقات الزرد مشلولة ومثبتة في أربعة مواقع (رموز متقاطعة) على طبق سيلجارد لتسجيل الاستقرار. تمثل الصلبان الغامقة نقاط إ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 100 مل دورق بيركس 1000 وعاء للحفر هدف الغمر في الماء 10x أوليمبوس UMPLFLN10xW تكبير منخفض لتحديد موضع اليرقات وتسجيل القطب الكهربائي هدف الغمر في الماء 40x أوليمبوس LUMPLFLN40XW تكبير أعلى لطرف القطب الكهربائي الموضع وإنشاء مشبك التصحيح الكابلات المحورية BNC ثورلاب 2249-ج-12 توصيل قنوات مكبر الصوت والمحول الرقمي ؛ تتطلب 4 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط وارنر إنسترومنتس G150F-3 القطر الداخلي: 0.86 ، القطر الخارجي: 1.50 ؛ زجاج شعري يستخدم لتشكيل أقطاب تسجيل حاسوب غير متاح غير متاح يجب أن يعمل أي جهاز كمبيوتر التيار المستمر التيار الكهربائي تينما 72-420 تستخدم لنقش دبابيس التشريح كهربائيا محول رقمي الفيزيولوجيا الكهربية أدوات المحور العصبي ، الأجهزة الجزيئية أكسون ديجي داتا 1440 أ يتيح الحصول على بيانات مشبك التصحيح خيوط شركة سوتر للأدوات FB255B خيوط صندوقية مقاس 2.5 مم تستخدم في مجتذب الماصات الدقيقة ملقط ناعم أدوات العلوم الدقيقة Dumont # 5 (0.05 × 0.02 مم) رقم الصنف 11295-10 تستخدم لمعالجة اليرقات وإدخال المسامير مجهر DIC للمرحلة الثابتة أوليمبوس BX51WI المجهر المستخدم لتصور وإنشاء تسجيلات مشبك التصحيح طرف ماصة مرن مدبب فيشر ساينتيك 02-707-169 تتيح الأطراف المرنة الإدخال في قطب التسجيل لتوزيع محلول خارج الخلية عند الطرف فلورو ديش شركة World Precision Instruments Inc. FD3510-100 غطاء طبق تسجيل الطبق ذو القاع الزجاجي كيم واي كيم تك 34155 [م] مسح المهام يستخدم لإزالة السوائل الزائدة من اليرقات كويك جارد شركة World Precision Instruments Inc. 710172 المطاط الصناعي سيلغارد ذاتي الخلط مضخم القطب الكهربائي الدقيق أدوات المحور العصبي ، الأجهزة الجزيئية MultiClamp 700B مضخم مشبك التصحيح للتسجيلات ثنائية القناة ميكروفورج ناريشيجي MF-830 microforge لتلميع قطب التسجيل وحدة التحكم في Micromanipulator سيسكيو MC1000-eR / T منسق الاتصال الهاتفي ذو 4 محاور للتحكم في الملاعب الدقيقة مجتذب الماصات الدقيقة شركة سوتر للأدوات مشتعل / بني P-97 لسحب الزجاج الشعري إلى أقطاب تسجيل وحدة التحكم في المجهر سيسكيو MC1000e يضع المجهر حول المرحلة الثابتة والتحضير مناور دقيق بمحركات سيسكيو طراز MX7600 يضع منصة الرأس وقطب التسجيل المرفق للتسجيل المشبك الرقيع قائد MultiClamp الأجهزة الجزيئية 2.2.2 قابل للتنزيل من صفحة تنزيل Axon MultiClamp 700B Commander طاولة الهواء البصرية شركة نيوبورت VH3036W الأراضي الفلسطينية المحتلة طاولة عزل اللوح لتعويم المجهر وتقليل الاهتزازات أثناء التسجيلات بكلامب الأجهزة الجزيئية 10.7.0 قابل للتنزيل من Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software تنزيل صفحة تنزيل طبق بيتري صقر 35-3001 تستخدم لغمر اليرقات في حالة شلل حامل الماصة الأجهزة الجزيئية 1-إتش إل يو أمسك قطب التسجيل وقم بتوصيله بمنصة الرأس محول الطاقة الهوائي فلوك الأدوات الطبية الحيوية DPM1B للتحكم في الضغط الداخلي لقطب تسجيل هيدروكسيد البوتاسيوم سيجما ألدريتش 221473-25 جرام حفر لنقش دبابيس التشريح أنابيب سيليكون تيجون 14-169-1 أ أنابيب لتوصيل محول الطاقة الهوائي بحامل الماصة مجهر مجسمة كارل زايس ستيمي 2000-سي تستخدم لتصور أطراف الدبوس وأثناء تحضير اليرقات شفرة حلاقة ذات حافة مستقيمة كانوب اطلب من amazon.com يقطع سلك التنغستن أثناء عمل دبابيس التشريح حقنة بيكتون ديكنسون كومباني 309602 مملوءة بمحلول خارج الخلية للحقن في أقطاب التسجيل نقل الماصة سيجما ألدريتش Z135003-500 إيه ماصة غير معقمة للاستخدام مرة واحدة لنقل اليرقات تريكايين ميثان سولفونات سيندل 12854 [م] مخدر صيدلاني يستخدم للقتل الرحيم لليرقات بجرعات عالية. سلك التنغستن شركة World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 بوصة ، قطر 50.8 ميكرومتر ؛ تستخدم لصنع دبابيس التشريح وحدة الترشيح الفراغي سيجما ألدريتش SCGVU11RE تستخدم وحدات الترشيح الفراغية ذات الاستخدام الواحد والمعقمة لتعقيم المحلول خارج الخلية المستخدم في جرس الفيزيولوجيا الكهربية الجهد المشبك الحالي المشبك headstage الأجهزة الجزيئية السيرة الذاتية 7 ب مزود بمكبر للصوت MultiClamp 700B يستخدم كرؤوس للرأس الأيمن والأيسر α-بنجاروتوكسين ثيرموفيشر ب 1601 لتثبيت اليرقات قبل التسجيل