قياس ديناميكيات تركيز أيون البوتاسيوم المستحثة في شرائح الحصين الإكليلية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Octeau ، J. C. et al. صنع واختبار واستخدام أقطاب كهربائية دقيقة انتقائية لأيون البوتاسيوم في شرائح أنسجة دماغ البالغين. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح الفيديو ديناميكيات تركيز أيونات البوتاسيوم المستحثة على التحفيز الكهربائي لشرائح دماغ الحصين الإكليلية للفأر. يتم إدخال قطب محفز ثنائي القطب في الطبقة الرادياتية لمنطقة CA3 في الحصين ، ويتم وضع قطب كهربائي انتقائي لأيون البوتاسيوم في الطبقة CA1 رادياتوم. يتسبب التحفيز الكهربائي في جهد فعل ، مما يؤدي إلى إطلاق أيون البوتاسيوم. أخيرا ، يؤكد عدم وجود استجابة أيونات البوتاسيوم المستحثة في وجود جزيء مثبط أن ديناميكيات تركيز أيون البوتاسيوم ترجع إلى توليد جهد الفعل في ضمانات شافر.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير شرائح الدماغ

الحادة في الحصين

1. تحضير حلول الشرائح
   1. تحضير محلول قطع السكروز 500 مل يتكون من: 194 ملي من السكروز ، 30 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.5 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي مولار د-جلوكوز ، 1 ملي ملي مغنيد كلوريد₂ ، 1.2 ملي هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، و 26 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم₃ ، 290-300 ملي أسم ، مشبع بنسبة 95٪ O₂ و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. تحضير 1-2 لتر من محلول التسجيل (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي ، ACSF) يتكون من: 124 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.5 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي مللي كلوريد₂ ، 10 ملي مولار د-جلوكوز ، 2 ملي كلور_{المكالسيوم 2} ، 1.2 ملي هيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ ، و 26 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم₃ ؛ الرقم الهيدروجيني 7.3 - 7.4 (بعد الفقاعات) ، 290 - 300 ملي أسمول ، مشبع ب 95٪ O₂ و 5٪ CO₂. املأ دورق يحتوي على حجرة حامل شريحة الدماغ بمحلول التسجيل واحتفظ به عند 32-34 درجة مئوية. املأ غرفة الاهتزاز بطين الماء المثلج.
2. تحضير شريحة حادة
   1. قم بتخدير الفأر بعمق عن طريق وضعه في وعاء جرس مشحون مسبقا ب 2-3 مل من الأيزوفلوران. تحقق من وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، وإذا لم يكن مستجيبا ، فقم بقطع رأسه بسرعة باستخدام زوج من المقصات الحادة أو المقصلة كما يتطلبه بروتوكول الخاص بك.
   2. قم بعمل شق 2-3 سم باستخدام مقصات من الجزء الذيلي من الجمجمة لقطع فروة الرأس على طول خط الوسط. أثناء سحب فروة الرأس يدويا ، قم بعمل شقين أفقيين بطول 1 سم من الثقبة الماغنوم على طول جانبي الجمجمة. ثم ، باستخدام مقصات دقيقة ، قم بقطع شق بطول الجمجمة ، على طول خط الوسط من الجزء الخلفي من الجمجمة إلى الأنف.
   3. باستخدام ملقط دقيق يتم إدخاله بالقرب من خط الوسط، اسحب الجمجمة المقطوعة إلى جزأين. استخرج دماغ الفأر من الجمجمة واستخدم شفرة لإزالة المخيخ والبصيلات الشمية ، والتي تقع على التوالي في الأجزاء الذيلية والمنقارية من الدماغ. يمكن التعرف عليها من خلال الشقوق الكبيرة التي تفصلها عن القشرة.
   4. قم بتركيب كتلة الدماغ على صينية الاهتزاز باستخدام الغراء الفائق. املأ صينية الاهتزاز بمحلول التقطيع المثلج.
   5. قطع أقسام الأنسجة على المستوى الإكليلي بسمك 300 ميكرومتر. عادة ، يمكن جمع 6 شرائح من الحصين الإكليلي.
   6. بعد قطع كل قسم ، انقل الشرائح على الفور إلى الشريحة التي تحمل دورق دافئ إلى 32-34 درجة مئوية. احتفظ بالأقسام في درجة الحرارة هذه لمدة 20 دقيقة قبل إزالة الدورق الذي يحتوي على الأقسام وضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل.

< p class = "jove_title" >2. قياس ديناميكيات K ⁺ المستحثة كهربائيا

1. إعداد تحضير الشريحة
   1. ضع شريحة الدماغ برفق في الحمام باستخدام ماصة باستور وثبتها برفق في مكانها باستخدام قيثارة بلاتينية مع خيوط من النايلون.
   2. تأكد من أن أطراف القطب المحفز ثنائي القطب متوازية مع بعضها البعض ومستوية مع مستوى الشريحة. ببطء ، على مدار 6-7 ثوان ، أدخل الأقطاب الكهربائية في طبقة CA3 رادياتوم بعمق 40-50 ميكرومتر تقريبا لتحفيز ضمانات شافر. في الأقسام الإكليلية ، يمكن تحديد CA3 تقريبا على أنه جزء من الحصين الجانبي المناسب لطبقة الخلية الحبيبية في جنس الحصين ، مع سقوط الطبقة الرادياتومية الإنسية والبطنية إلى طبقة الخلية الهرمية.
   3. أدخل القطب الكهربي الانتقائي K ⁺ بعناية في رادياتوم الطبقة CA1 بعمق 50 ميكرومتر تقريبا ، عن طريق خفض القطب ببطء خلال حوالي 3-4 ثوان. اسمح للإمكانية بالاستقرار عبر القطب الكهربائي قبل تطبيق التحفيز على الشريحة: يستغرق هذا عادة من 5 إلى 10 دقائق. إذا أظهرت الشريحة تغيرات تلقائية في K ⁺ خارج الخلية ، فتخلص من هذه العملية وكررها بشريحة جديدة.
2. قياس إصدار K⁺ المستحضر
   1. قم بتطبيق قطارات التحفيز الكهربائي (8 نبضات) عن طريق الضغط يدويا على الزناد على المحفز أثناء تسجيل الاستجابات رقميا. قم بتطبيق التحفيز عند عرض النبضة 10 هرتز و 1 مللي ثانية ، بدءا من سعة التحفيز 10 ميكرو أمبير.
   2. قم بتطبيق اتساع التحفيز المتزايد بمعامل 2 حتى يتم اكتشاف أقصى سعة استجابة K ⁺. إذا كنت لا ترى أي استجابة ، فحرك موضع القطب K ⁺ بالقرب من موقع التحفيز بزيادات قدرها 100 ميكرومتر
   3. حدد سعة التحفيز التي تنتج نصف الاستجابة القصوى. في تجربتنا ، يتراوح هذا بين 40-160 ميكرو أمبير ، اعتمادا على جودة التحضير وعمر والمسافة بين أقطاب التحفيز والقطب الانتقائي K ⁺.
   4. في نفس الشريحة ، باستخدام سعة التحفيز عند خطوة واحدة أقل من السعة التي تنتج نصف الاستجابة القصوى (على سبيل المثال ، إذا أنتجت 80 μA استجابة نصف قصوى ، استخدم 40 μA) قم بتطبيق قطارات التحفيز ذات العدد المتزايد من النبضات. في البداية ، استخدمنا قطارات من 1 و 2 و 4 و 8 و 16 و 32 و 64 و 128 نبضة.
   5. للتأكد من أن إشارات K ⁺ يتم التوسط فيها عن طريق إطلاق جهد الفعل لحمام ضمانات شافر المحفز كهربائيا ، قم بتطبيق 0.5 ميكرومتر من السموم الرباعية (TTX) في ACSF لمدة 10 دقائق وكرر بروتوكول التحفيز. وينبغي عدم ملاحظة أي ردود مستثارة.
   6. بعد الانتهاء من تجربة الشريحة ، تأكد من أن القطب قد حافظ على مسؤوليته عن طريق إعادة معايرة القطب الكهربائي في محاليل المعايرة والتأكد من عدم انحراف الاستجابة بأكثر من 10٪ عن المعايرة الأولية

المواد