تحليل إفراز الغلوتامات وإزالتها في مشبك خلية عصبية واحدة في شريحة دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Dvorzhak، A. et al.، مؤشرات المشبك الفردي لإطلاق الغلوتامات وامتصاصها في شرائح الدماغ الحادة من الفئران العادية وهنتنغتون.

يوضح هذا الفيديو تقييم إفراز الغلوتامات وإزالتها في نقاط الاشتباك العصبي القشرية المفردة في شريحة دماغ الفأر. يسهل التحفيز الكهربائي إطلاق الغلوتامات في المشبك. تغير الغلوتامات المنبعثة مضان بروتين المستشعر ، والذي يتحلل بمرور الوقت ، مما يشير إلى كفاءة الإطلاق والتخليص.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

ملاحظة: يمكن إجراء التسجيلات من النوع البري Q175 (WT) وغيرية الزيجوت (HETs) في أي عمر وجنس. درسنا هنا الذكور والإناث في سن 51 إلى 76 أسبوعا.

فئة < p = "jove_title" >1. حقن مستشعر الغلوتامات iGlu_u للتعبير في المحاور القشرية

1. استخدم مجتذب الماصة (وضع خطوة واحدة) لتحضير ماصات زجاجية من البورسليكات لحقن الفيروس. بعد السحب ، اكسر الماصة يدويا للحصول على قطر طرف يتراوح بين 30 و 50 ميكرومتر. تعقيم الماصة والأدوات الجراحية، بما في ذلك مثقاب فتح الجمجمة.
2. تخزين الفيروس AAV9-CaMKIIa.iGlu_u. WPRE-hGH (7.5 × 10¹³جم / مل) عند -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر حصص. إذا تم إجراء الحقن بعد فترة وجيزة من إنتاج الفيروس (خلال 6 أشهر) ، يحفظ في درجة حرارة 5 درجات مئوية. قبل الجراحة ، أخرج القارورة واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة.
3. املأ الماصة الزجاجية وقم بإزالة أي فقاعات.
4. تخدير بحقن داخل الصفاق لمحلول يحتوي على 87.5 مجم / كجم من الكيتامين و 12.5 مجم / كجم زيلازين. حقن 0.25٪ بوبيفاكين تحت الجلد (8 مجم / كغ) لتخفيف الآلام بشكل إضافي. تحقق من عمق التخدير من خلال مراقبة قوة العضلات وملاحظة عدم وجود ردود أفعال ناتجة عن الألم.
5. احلق جلد الرأس وعقمه بالكحول بنسبة 70٪. قم بتركيب الماوس في الإطار التجسيمي.
6. استخدم مشرطا لإزالة الجلد ومثقابا عالي السرعة (38,000 دورة في الدقيقة) لعمل ثقب 1.2 مم في العظم فوق القشرة الحركية.
7. قم بتركيب المحقنة بماصة الحقن المرفقة في حامل مناور دقيق. أدخل الماصة ذات الاتجاه الرأسي في القشرة في 4 مواقع مختلفة. إحداثيات الحقن هي ، فيما يتعلق ببريجما (بالمليمتر): الأمامي 1.5 ، الجانبي 1.56 ، 1.8 ، 2.04 ، 2.28. العمق فيما يتعلق بالأم الجافية (بالمليمتر): 1.5-1.7.
8. باستخدام نظام الحقن ، قم بحقن 0.3 ميكرولتر لكل موقع من محلول الفيروس غير المخفف بسرعة 0.05 ميكرولتر / دقيقة. بعد كل حقنة، اترك الماصة في مكانها لمدة دقيقة واحدة قبل سحبها ببطء (1 مم/دقيقة).
9. انتهي بإغلاق الجرح الجراحي بخياطة من النايلون.
10. اترك الماوس لمدة 0.5 إلى 1 ساعة على وسادة تدفئة في قفص نظيف قبل إعادته إلى قفصه الأصلي.
11. حافظ على الماوس على دورة 12 ساعة ليلا ونهارا لمدة 6 إلى 8 أسابيع قبل تحضير شرائح الدماغ الحادة.
    ملاحظه: لتجنب التفاعلات المناعية التي تؤدي إلى تلف الخلايا وفقدان المشبك ، يجب إجراء حقن العديد من التركيبات الفيروسية في وقت واحد أو في غضون 2-3 ساعات بعد الحقن الأولي. تم اختيار إحداثيات حقن iGlu_u وفقا لأطلس الدماغ Paxinos و Franklin. أنها تتوافق مع القشرة الحركية M1. تصور التلوين المناعي للأدمغة المحقونة العديد من المحاور والدوالي العصبية المعزولة جيدا في المخطط المقابل وفي القشرة M1 و S1 المقابلة.

2. ابحث عن أطراف الجلوتامات التي تعبر عن مستشعر الغلوتامات iGlu_u

1. وضع المعايرة
   1. قم بإعداد كاميرا sCMOS وبرنامج التحكم في الكاميرا بالإعدادات التالية. في صفحة القراءة، قم بتعيين معدل قراءة البكسل: 560 ميجاهرتز (= أسرع قراءة)، الحساسية/النطاق الديناميكي: بت، مرشح الضوضاء الزائفة: نعم، قراءة التداخل: نعم. في صفحة Binning/عائد الاستثمار، حدد ملء الشاشة.
   2. قم بإعداد شريحة زجاجية تحتوي على قطرة 5 مجم / مل من لوسيفر الأصفر (LY) تحت زلة غطاء.
   3. ضع شريحة LY تحت هدف 63x ، وافتح غالق الليزر وقم بإجراء عملية استحواذ تسلسلية باستخدام الإعدادات التالية: تجميع البكسل: 1x1 ، وضع المشغل: داخلي ، وقت التعريض الضوئي: الحد الأدنى (يتم تحديده لاحقا).
   4. اضبط طاقة الليزر لإنتاج بقعة مضان قطرها 4 ميكرومتر (يجب ألا تحتوي الصورة على وحدات بكسل مشبعة).
   5. لإجراء معايرة لنظام تحديد المواقع بالليزر، حدد الإعدادات التالية في برنامج تحديد المواقع بالليزر: قطر حجم البقعة: 10، سرعة المسح: 43.200 كيلو هرتز. انقر على بدء الحصول على الصور زر في اللوحة اليمنى. قم بتعيين عمليات التشغيل: 0 ، تأخير التشغيل: 0 ، وحدد خيار التشغيل عند TTL في صفحة التسلسل. انقر فوق الزر معايرة في صفحة المعايرة وقم بمعايرة برنامج التحكم بالليزر وفقا للإرشادات الموضحة في الزاوية العلوية اليسرى من شاشة الاستحواذ.
   6. إذا كان الإعداد يستخدم برنامجا مستقلا للتحكم في الكاميرا والليزر، فاحصل على لقطات شاشة من نافذة الحصول على الكاميرا وأرسلها إلى برنامج التحكم بالليزر لإعادة حساب إحداثيات XY. إذا تم تثبيت البرنامج على أجهزة كمبيوتر مختلفة ، فاستخدم أداة التقاط الفيديو لاستيراد الصورة إلى برنامج التحكم بالليزر. سيحتاج برنامج التحكم بالليزر إلى معلومات حول عوامل قياس XY والتعويضات. لهذا الغرض ، حدد إحداثيات الزوايا العلوية اليسرى والسفلية اليسرى والسفلية اليمنى للصورة داخل نافذة الاستحواذ على برنامج التحكم بالليزر. احسب عوامل القياس وفقا للمعادلات التالية: عامل X = (X أسفل اليمين - X أسفل اليسار) / 2048 ، إزاحة X = X أسفل اليسار ، عامل Y = (Y أعلى اليسار - Y أسفل اليسار) / 2048 ، إزاحة Y = Y أسفل اليسار.
   7. في نهاية إجراء المعايرة، قم بإنشاء منطقة مستطيلة ذات اهتمام (ROI) تبلغ 267 × 460 بكسل، وانقلها إلى منتصف الشاشة وانقر فوق الزر بدء التسلسل.
   8. ارجع إلى إعدادات برنامج التحكم في الكاميرا التالية: Binning: 2x2، وضع الزناد: التعريض الخارجي، وقت التعريض الضوئي: الحد الأدنى (سيتم تحديده لاحقا).
2. وضع تصحيح التألق الذاتي
   ملاحظة: عادة ما يكون مستوى الراحة ل [Glu] في بيئة المحطات المشبكية النشطة أقل من 100 نانومتر. وفقا لذلك ، فإن أي مستشعر للغلوتامات ، وخاصة مستشعر التقارب المنخفض مثل iGlu_u سيكون باهتا إلى حد ما في حالة عدم وجود إطلاق الغلوتامات المتشابك. ومع ذلك ، يمكن اكتشاف بعض iGlu_u التألق أثناء الراحة ، ولكن يجب تمييزه عن التألق الذاتي للأنسجة. تثير الإضاءة 473 نانومتر كلا من iGlu_u المضان والتألق الذاتي (الشكل 1A-C). يحتل هذا الأخير نطاقا واسعا من الأطوال الموجية ، بينما يقتصر iGlu_u الفلورة على 480-580 نانومتر (بحد أقصى عند 510 نانومتر). يعتمد تصحيح التألق الذاتي على الحصول على صورتين بمرشحات عالية التمرير مختلفة.
   1. قم بإعداد شرائح الدماغ مسبقا كما هو موضح في مكان آخر. احتفظ بشرائح النخالة جاهزة.
   2. انقل الشرائح إلى غرفة التسجيل ، واغمرها في سائل دماغي صخاري اصطناعي مؤكسج (ACSF) يحتوي على 125 ملي كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 3 ملي كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 1.25 ملي مولار فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين (NaH₂PO₄) ، 25 ملي مولار بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) ، 2 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) ، 1 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂)، 10 ملي مولار جلوكوز (درجة الحموضة 7.3، 303 ملي أسم/لتر)، مكمل ب 0.5 ملي مولار بيروفات الصوديوم، 2.8 ملي أسكوربات الصوديوم و0.005 ملي مولار الجلوتاثيون. استخدم معدل تدفق يتراوح بين 1 و2 مل / دقيقة. حافظ على درجة حرارة الحمام عند 28-30 درجة مئوية.
   3. حدد موقع المخطط الظهري تحت هدف الغمر في الماء 20x. ثبت الشرائح بشبكة من النايلون على قيثارة بلاتينية لتقليل حركة الأنسجة. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 63x / NA 1.0. مرشحات محددة تعكس الضوء عند 473 نانومتر (مرآة ثنائية اللون) وتمر الضوء بأطوال موجية >510 نانومتر (مرشح انبعاث).
   4. قم بمزامنة الإضاءة والتحفيز والحصول على الصور باستخدام لوحة تناظرية إلى رقمية (AD) / رقمية إلى تناظرية (DA) (AD / DA) مع برنامج التحكم المعني. اضبط برنامج الزناد للتحكم في الاستحواذ بوقت تعرض ليزر يبلغ 180 مللي ثانية ووقت الحصول على الصورة يبلغ 160 مللي ثانية. استخدم جهاز تحديد المواقع بالليزر لإرسال شعاع الليزر إلى عدد محدد مسبقا من النقاط وتحديد إعدادات سرعة المسح وحجم البقعة.
   5. احصل على صورة لكل من الهياكل المضألة الذاتية وiGlu الإيجابية_{باستخدام} مرشح تمرير عالي عند 510 نانومتر ("صورة صفراء").
   6. احصل على صورة بالتألق الذاتي وحده باستخدام مرشح تمرير عالي عند 600 نانومتر ("صورة حمراء").
   7. قم بقياس الصور الحمراء والصفراء، باستخدام متوسط شدة 10 بكسل سطوعا وأغمق 10 بكسل لتحديد النطاق. قم بإجراء طرح "أصفر ناقص الصورة الحمراء" وأعد قياس الصورة المطروحة لإنشاء ملف tif قياسي 8 بت لتصور مريح للعنة محل الاهتمام (الشكل 1 د). يحتوي على وحدات البكسل الساطعة من هياكل iGlu الإيجابية_، ووحدات البكسل الرمادية من الخلفية والبكسل الداكن من الهياكل ذات التألق الذاتي.
      ملاحظه: مع المعدات المحددة ، سيكون متوسط التألق أثناء الراحة (F) أقل من 700 A.U.
3. وضع البحث Bouton
   ملاحظة: قد تنتمي وحدات البكسل الموجبة_{على شكل} حرف iGlu إلى عناصر مختلفة وظيفيا من الشجرة المحورية ، مثل الفروع المحورية ذات الترتيب المختلف ، ومواقع التشعب ، والدوالي بعد استنفاد الحويصلة أو الدوالي النشطة بالكامل. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تحديد المحطات المشبكية الوظيفية فقط عن طريق الفحص البصري. لذلك ، يحتاج كل طرف متشابك جلوتاماتيرجيك إلى تحديد من خلال استجابته لإزالة الاستقطاب الكهربائي. يجب تجاهل المواقع التي لا تستجيب للتحفيز. الوسيلة الفسيولوجية للحث على إطلاق الغلوتامات من المحاور القشرية هي استنباط جهد الفعل. يمكن تحقيق ذلك إما باستخدام قناة رودوبسين ذات خصائص طيفية مناسبة أو عن طريق التحفيز الكهربائي لمحور عصبي يتصوره iGlu_u نفسه. لتجنب التنشيط العرضي للعمليات ، فضلنا هذا الأخير
   1. استخدم مجتذب الماصات الدقيقة (في وضع من أربع خطوات) لإنتاج ماصات تحفيز من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسيليكات. يجب أن يكون قطر الطرف الداخلي حوالي 1 ميكرومتر. عند ملؤها ب ACSF ، يجب أن تكون مقاومة القطب حوالي 10 MΩ.
   2. للحث على إطلاق الغلوتامات المعتمد على جهد الفعل من مجموعة من العروات المشبكية المتصلة بنفس المحور العصبي ، استخدم التكبير 63x ومرشح الانبعاث 510 نانومتر والصورة المطروحة لوضع قطب تحفيز زجاجي بجوار الدوالي الفلورية. تجنب قرب المحاور الإضافية.
   3. قم بتشغيل المحفز لتوصيل نبضات تيار مزيلة للاستقطاب إلى ماصة التحفيز. استخدم شدة التيار حوالي 2 ميكرو أمبير (لا تزيد عن 10 ميكرو أمبير).
   4. قم بتشغيل نظام تطبيق الحمام متعدد القنوات حيث توفر إحدى القنوات حل الحمام القياسي وتوفر القنوات الأخرى الحاصرات اللازمة للقنوات الأيونية أو الناقلات أو المستقبلات الغشائية. تحكم في التدفق في موقع التسجيل ثم قم بالتبديل إلى قناة السموم الرباعية (TTX) (محلول الحمام بالإضافة إلى 1 ميكرومتر TTX). بعد 2-3 دقائق ، قم بتحفيز عنة الاهتمام مرة أخرى ، ولكن الآن في غياب توليد إمكانات العمل. يرجع الإطلاق مباشرة إلى تدفق الكالسيوم عبر قنوات الكالسيوم المعتمدة على الجهد.
   5. عن طريق تشغيل مفتاح الشدة على المحفز ، اضبط تيار التحفيز للحصول على استجابات مشابهة لتلك المستمدة عبر إمكانات الفعل. عادة ما يكون تيار التحفيز حوالي 6 ميكرو أمبير لإزالة الاستقطاب 0.5 مللي ثانية.
   6. للاختبار الأساسي للمستحضر ، ضع 0.5 ملي مولار CdCl₂. إن وجود هذا المانع لقنوات الكالسيوم يمنع إطلاق الغلوتامات المشبكية تماما من إطلاق الغلوتامات المشبكية وبالتالي التحقق من صحة اعتماد الكالسيوم لإشارة الغلوتامات المستحثة مباشرة.
      ملاحظه: قد تساعد التوصية العامة التالية في زيادة معدل نجاح تجارب المشبك الفردي في المخطط. لتحديد المحطات المشبكية الجلوتاماتيرجية مع آلية الإطلاق السليمة ، يجب أن تكون الدوالي: (أنا) لها شكل ناعم يشبه المغزل ؛ (2) ألا يرتبط بتشعب المحور العصبي ؛ (3) أن تكون أكثر إشراقا من الهياكل الأخرى على "الصورة الصفراء" ؛ (رابعا) يقيم في العصبية المخططة بدلا من المسالك الليفية ؛ (ت) تقيم على فرع محوري رفيع جدا ؛ (6) لا توجد داخل الأجزاء العميقة من الشريحة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تصور إطلاق الغلوتامات وإزالتها

1. وضع التسجيل
   ملاحظة: بعد طرح التألق الذاتي (الخطوة 2.2) وبعض الاختبارات الأولية لاستجابة العروة محل الاهتمام (الخطوة 2.3) ، يمكن أن يبدأ الحصول على البيانات. يمكن ملاحظة الاستجابات للتنشيط الكهربائي لإطلاق الغلوتامات من أطراف المحور العصبي الفردي في الصورة مباشرة (الشكل 2) ، دون تطبيق المزيد من أدوات التحليل. ومع ذلك ، فقد ثبت أنه من الملائم جدا استخراج بعض المؤشرات الأساسية لأداء المشبك على الفور (الشكل 3). هذه المعلومات مطلوبة لاتخاذ قرارات بشأن مسار التجربة اللاحق ، مثل اختيار أنواع معينة من المحطات ، والتقييم السريع للتعديلات المرتبطة ب HD ، وعدد وتواتر التجارب أو الأدوية التي سيتم تطبيقها مع نظام التروخي الفائق. قد يكون من الضروري أيضا التعامل مع القطع الأثرية التي تظهر في النهاية. أولا ، يتم وصف الإعدادات القياسية لتسجيل البيانات.
   1. باستخدام محركات أقراص المجهر XY، ضع العروة الإيجابية_{على شكل حرف} U iGlu التي تم اختبارها بالقرب من مركز مجال الرؤية. أوقف الحصول على الصورة باستخدام زر الحصول على الإجهاض. في آخر صورة تم الحصول عليها ، حدد موضع XY لمركز العروة المريح بالنقر فوقه باستخدام زر الماوس الأيسر. ستظهر إحداثيات XY لمؤشر المجموعة على لوحة الحالة السفلية لنافذة الاستحواذ.
   2. باستخدام بيانات المعايرة (الخطوة 2.1.6), احسب إحداثيات الموقع حيث يجب إرسال شعاع الليزر لإثارة iGlu_{u مضانة}. استخدم المعادلات التالية: ليزر X = كاميرا X * عامل X + إزاحة X ، ليزر Y = إزاحة Y - كاميرا Y * عامل Y. أثناء إجراء إعادة الحساب هذه ، انتبه إلى إعدادات الوجه الرأسي أو الأفقي للكاميرا.
   3. قم بإنشاء تسلسل من نقطة واحدة في برنامج التحكم بالليزر باستخدام الإحداثيات المحسوبة. لهذا الغرض، حدد نقطة في مربع إضافة إلى التسلسل في صفحة التسلسل في برنامج التحكم بالليزر. حدد 10 ميكرو ثانية للتأخير لبدء التشغيل و 180 مللي ثانية لوقت نبضة الليزر. حرك الماوس إلى الإحداثيات المحسوبة وانقر فوق الزر الأيسر.
   4. حدد الإعدادات التالية في برنامج التحكم بالليزر: التشغيل: 0 ، تأخير التشغيل: 0 ، التسلسل: التشغيل في TTL. ثم انقر فوق بدء التسلسل.
   5. في برنامج التحكم في الكاميرا، حدد الإعدادات التالية: في صفحة Binning/ROI، اضبط منطقة الصورة: مخصص، تجميع البكسل: 2x2، الارتفاع: 20، العرض: 20، اليسار: إحداثيات X لبقعة iGlu الإيجابية_للu u، ناقص 10 بكسل، أسفل: إحداثيات Y لبقعة iGlu الإيجابية_{للحرف U} المريحة ناقص 10 بكسل، وضع الاستحواذ: السلسلة الحركية، طول السلسلة الحركية: 400 ، وقت التعرض: 0.0003744 ثانية (الحد الأدنى من القيمة). مع هذه الإعدادات ، سيكون معدل الاستحواذ 2.48 كيلو هرتز.
   6. حدد وضع المشغل: خارجي. انقر فوق أخذ إشارة في برنامج التحكم في الكاميرا. ابدأ البروتوكول التجريبي الموضوع لجهاز المشغل.
   7. تنفيذ البروتوكول التجريبي التجريبي مع الخط الزمني التالي: 0 مللي ثانية - بدء التجربة ، 1 مللي ثانية - بدء إضاءة الليزر ، 20 مللي ثانية - بدء الحصول على الصور بالكاميرا, 70 مللي ثانية - بدء التحفيز الكهربائي 1 ، 120 - بدء التحفيز الكهربائي 2 ، 181 مللي ثانية - انتهاء التجربة (إيقاف تشغيل الليزر والكاميرا). وهكذا ، خلال تجربة واحدة ، تكتسب الكاميرا 400 إطار بتردد 2.48 كيلو هرتز. انظر الخطوتين 2.3.3 و 2.3.5. للحصول على تفاصيل حول التحفيز الكهربائي.
   8. للسماح باسترداد كاف لتجمعات الحويصلات قبل المشبكية ، قم بتطبيق البروتوكول Trial بتردد تكرار 0.1 هرتز أو أقل.
2. بناء الغلوتامات العابر خارج الخط والتقييم السريع لإطلاق الغلوتامات وإزالتها لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المرضية
   1. قم بتشغيل إجراءات التقييم. هنا ، نستخدم برنامجا مكتوبا داخليا SynBout v. 3.2. (المؤلف: أنطون دفورزاك). الخطوات التالية مطلوبة لإنشاء عابر ΔF / F من وحدات البكسل ذات التألق iGlu_u المرتفع كما في الفيديو في الشكل 2.
   2. لتحديد حجم العروة ، احسب المتوسط والانحراف المعياري (SD) لشدة مضان عائد الاستثمار في حالة السكون (F) ، قبل بداية التحفيز. حدد المساحة التي تشغلها وحدات البكسل ووضعها في الصندوق باستخدام F>mean + 3 SD (الشكل 3 أ). حدد القطر الافتراضي (بالميكرومتر) بافتراض شكل دائري لمنطقة فوق العتبة.
   3. حدد ΔF على أنه الفرق بين قيمة شدة الذروة و F. ارسم التيار المحفز و ΔF / F مع الوقت (الشكل 3 ب). احسب SD ل ΔF / F في حالة السكون (قبل بداية التحفيز) و "سعة الذروة". استخدم البكسل بسعة الذروة أكثر من 3 SD من ΔF / F لإجراء تركيب أحادي الأسي للاضمحلال من الذروة. حدد الثابت الزمني للاضمحلال TauD ل ΔF / F.
   4. لتقدير "السعة القصوى" عند مشبك معين ، حدد البكسل بأعلى قيمة ΔF / F. وعادة ما يكون داخل أو بجانب حدود العروة الراحة, iGlu_u الفلور. سيكون "السعة القصوى" أفضل مؤشر على حمل الغلوتامات المقدم إلى آلية الإزالة لمشبك واحد.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحديد الدوالي_{الإيجابية} iGlu. (أ) صورة مضان تم الحصول عليها باستخدام مرشح تمرير عالي 510 نانومتر ("صورة صفراء"). (ب) نفس مجال الرؤية الذي تم الحصول عليه باستخدام مرشاح تمرير عالي 600 نانومتر ("صورة حمراء"). لاحظ أن البقعة المميزة برأس السهم الأسود قد اختفت في (B). تراكب (أ) و (ب). السهم الأبيض = التألق الذاتي ، السهم الأسود = ال...

المواد