في الجسم الحي تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية لأنشطة الدماغ من مواقع متعددة في الفئران

الملخص

المصدر: Haumesser ، J. K. ، et al. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية الحادة في الجسم الحي لإمكانات المجال المحلي والنشاط متعدد الوحدات من المسار الفائق المباشر في الفئران المخدرة. (2017).

يوضح هذا الفيديو الإجراء التفصيلي لإعداد فأر مخدر للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لنشاط الدماغ من مواقع متعددة. يتم تشريح فروة الرأس للوصول إلى الجمجمة ، ويتم حفر الثقوب في مواقع محددة لتركيب الأقطاب الكهربائية وتأمينها. ثم يتم إدخال أقطاب التنغستن الصغيرة في الموقع المستهدف لتسجيل البيانات.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الجراحة

1. للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية ، استخدم اليوريثان (CAUTION) للتخدير.
   أنذر: اليوريثان سام ومسرطن ، لذلك التزم دائما بلوائح السلامة وورقة البيانات التي تقدمها الشركة المصنعة للمادة.
2. تحضير محلول 200 ملغم/مل يوريثان في محلول ملحي طبي من كلوريد الصوديوم 0.9٪.
3. يتناول ما مجموعه 1.3 غ/كغ من وزن الجسم يوريثان داخل الصفاق (IP). اعتمادا على سلالة الفئران ، قد يكون من المعقول تقسيم الجرعة إلى جرعتين بفاصل زمني مدته 15 دقيقة بين الحقن من أجل تعزيز سلامة التخدير.
4. تحقق من عمق التخدير باستخدام منعكس سحب الدواسة وردود الفعل المناسبة الأخرى. إذا لم يكن التخدير عميقا بما يكفي لإجراء الجراحة ، فقم بحقن 0.15 جم / كجم من وزن الجسم من يوريثان IP وانتظر 15 دقيقة أخرى.
5. ضع مرهم للعين لمنع جفاف القرنية.
6. راقب باستمرار معدل التنفس وانعكاس انسحاب الدواسة أثناء التخدير. استخدم وسادة تسخين صغيرة للحيوانات مع التحكم في درجة الحرارة لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية طوال الجراحة. قبل بدء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية ، قم بالتغيير إلى بديل غير كهربائي (مثل وسادة رأس أسيتات الصوديوم).
7. احلق الفراء بجانب الجانب الظهري من الرأس لتحقيق مجال جراحي نظيف. تطهير حول موقع الشق بمطهر جراحي مناسب. إصلاح في الإطار التجسيم.
8. قم بإجراء شق بطول 2 سم في فروة الرأس في الاتجاه السهمي باستخدام مشرط. استخدم مشرطا لكشط الجمجمة قليلا وتطهير الجمجمة. استخدم أعواد القطن المنقوعة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) لإزالة أي أنسجة متبقية.
9. استخدم الكي الكهربائي أو الكي الحراري للسيطرة على النزيف ، إذا لزم الأمر. وقف النزيف من عظم الجمجمة وتحت الجلد ، إذا لم يتوقف النزيف تلقائيا بعد 1-2 دقيقة ويعيق البصر على الجمجمة.
10. اضبط شريط القاطع حتى يتم وضع الرأس في وضع الجمجمة المسطحة ، مما يعني أن البريجما واللامدا كنقاط مرجعية تجسيمية في نفس المستوى. هذا هو الأهم لتحقيق دقة جراحية عالية. استخدم أداة محاذاة الفئران التجسيمية القياسية ، وقم بمعايرة الطرف المعين إلى بريجما تحت الرؤية المجهرية واضبط شريط القواطع حتى تلمس النقاط المخصصة للبريجما واللامدا على الأداة الجمجمة في نفس الوقت.
    ملاحظه: قد يساعد المنظر من جانب مع ضوء مركز من الجانب الآخر في تحديد هذه الحالة. بدلا من ذلك ، خذ حاملا مجسيما مع قنية دقيقة وقم بقياس الإحداثيات الظهرية البطنية ل Bregma و lambda تحت الرؤية المجهرية. اضبط شريط القاطع حتى تكون الإحداثيات الظهرية البطنية ل Bregma و lambda متماثلة.
11. استخدم حاملا تجسيما مع قنية ، وقم بمعايرة البريجما ، ثم احسب موضع جميع ثقوب الحفر على الجمجمة. باستخدام الحامل التجسيمي ، حدد مواضع الثقوب المراد حفرها إما عن طريق خدش الجمجمة بعناية أو باستخدام علامة ألوان جراحية. تعتمد إحداثيات ذلك على الأهداف. يتم إعطاء الإحداثيات بالإشارة إلى Bregma للمسار الفائق المباشر في الجدول 1 ، بما في ذلك الإحداثيات المقترحة للأقطاب الكهربائية المرجعية المخيخية.
12. باستخدام مثقاب صغير ، قم بحفر جميع الثقوب بعناية. بالنسبة للنواة تحت المهاد (STN) والشبكة الشبكية للمادة السوداء (SNr) ، قم بحفر حفرة مشتركة (بحجم 2 مم × 3 مم تقريبا). يجب أن يبلغ قطر جميع ثقوب الحفر الأخرى حوالي 1 مم.
13. خذ قنيتين رفيعتين (27 جم على الأقل) وثني أطرافهما لتشكيل شكل معقوف باستخدام سطح صلب أو ملاقط. استخدمها لإزالة أي حطام من فتحات الحفر ، وقم بقص وإزالة الأم الجافية بعناية في فتحة STN / SNr المشتركة.
14. اغسل فتحات الحفر بالمحلول الملحي الفسيولوجي. ضع قطرة من المحلول الملحي الفسيولوجي كل 15 دقيقة على فتحات الحفر لمنع الدماغ والجافية من الجفاف.
15. خذ مثقاب صغيرا وبرغي دقيق مطابق من الفولاذ المقاوم للصدأ (على سبيل المثال ، برغي M 1.2 مم × 2 مم) ، وحفر حفرة ، وقم بربط برغي صغير بين فتحات الحفر للأقطاب فوق الجافية المرجعية فوق المخيخ ، افعل الشيء نفسه مع الأقطاب فوق الجافية M1.
16. حرك الأقطاب فوق الجافية Ag / AgCl ذاتية الصنع في فتحات الحفر للأقطاب الكهربائية المرجعية والأقطاب الكهربائية M1. قم بتوجيه طرف القطب الكهربائي بملاقط دقيقة وحركه مباشرة أسفل عظم الجمجمة في فتحة الحفر.
17. قم بإصلاح جميع الأقطاب الكهربائية فوق الجافية بأكريليك الأسنان المكون من عنصرين. تأكد من عدم تغطية نقطة بريجما ولا التأثير على ثقب STN / SNr المشترك.
18. أدخل الحامل المجهز بأقطاب الأسلاك الدقيقة التنغستن في الإطار التجسيمي.
19. معايرة القطب البطني الأكثر ، والذي يهدف إلى استهداف STN ، إلى البرجما. اضبط على الموضع المحسوب فوق ثقب STN / SNr المشترك وقم بخفض الأقطاب الكهربائية إلى الدماغ تحت الرؤية المجهرية. تأكد من أن أقطاب الأسلاك الدقيقة التنغستن تدخل داخل الدماغ بسلاسة.

< p class = "jove_title" >2. رسم الخرائط والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية

ملاحظة: لهذه الخطوة ، من الضروري وجود قفص فاراداي ونظام تسجيل فيزيولوجي كهربائي متعدد القنوات مع برنامج تسجيل قادر على التصفية عبر الإنترنت وفرز السنبلة عبر الإنترنت. يفضل استخدام نظام يعمل مع مكبر للصوت موجود بالقرب من رأس للحفاظ على الضوضاء الكهربائية والتحف إلى الحد الأدنى المطلق. إلى جانب أقطاب التنغستن الصغيرة ، من الضروري وجود قطب فوق جافية واحد على الأقل وقطب مرجعي واحد لإجراء تسجيلات للمسار الفائق المباشر. يوصى بإدخال الأقطاب فوق الجافية والأقطاب المرجعية بشكل زوجي دون ملامسة بعضها البعض ، وهذا يساعد في حالة حدوث خلل ويسمح بأنواع مختلفة من المراجع في تحليل البيانات.

1. ضع قفص فاراداي متحرك فوق الإطار التجسيمي. إذا كان قفص فاراداي الثابت متاحا فقط ، فقم بتحريك الإطار التجسيمي بعناية إلى قفص فاراداي مع التأكد من عدم إنزال أقطاب الدماغ العميقة في الدماغ حتى يصبح الإطار التجسيمي في موضعه النهائي.
2. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمقدمة الإعداد الفيزيولوجي الكهربية. تأكد من توصيل الأقطاب الكهربائية المرجعية بالقنوات المرجعية المناسبة.
3. قم بإعداد برنامج التسجيل: مرشح ممر النطاق الترددي (0.05-8,000 هرتز) وتضخيم (كسب 1,500-2,000x) إشارة البيانات الأولية. استخدم مرشح LFP ومرشح سبايك عبر الإنترنت مع الإعدادات المناسبة (مرشح ممر النطاق 0.05-250 هرتز ل LFPs ، مرشح ممر النطاق 300-8,000 هرتز ل MUA). بالنسبة لجميع المرشحات ، استخدم مرشحا من نوع زبدة الزبدة
4. قم بإعداد حد الارتفاع المفاجئ، إن أمكن، لفرز الارتفاع المفاجئ عبر الإنترنت. تسمح معظم برامج التسجيل بإعداد عتبة الارتفاع ، وهي قيمة سعة يتم تمييز الإشارة فوقها على أنها ارتفاع بواسطة البرنامج. يمكن تحديد هذه العتبة رياضيا كعامل أو انحراف معياري لمتوسط سعة إشارة الارتفاع المفلترة ، أو يفضل تحديدها عن طريق الفحص البصري لمقاطع البيانات < 500 ms وإعدادها كخط فوق ضوضاء الإشارة في واجهة مستخدم رسومية.
   ملاحظه: القصد من إعداد عتبة الارتفاع هو حساب المسامير وفرز الوحدات من أجل توفير معلومات حول عدد الخلايا العصبية التي يتم تسجيلها حاليا وكيف يتم تشكيل مساميرها.
5. قم بخفض أقطاب الأسلاك الدقيقة التنغستن ببطء إلى 1 مم ظهرية للهدف ، وهي STN للمسار الفائق المباشر. انتظر حتى تستقر الإشارة إذا لزم الأمر.
6. لرسم الخرائط الفيزيولوجية الكهربية ، قم بتقدم الأقطاب الكهربائية بطنيا بخطوات 100 ميكرومتر. في كل خطوة ، قم بتقييم نمط إطلاق النار ومعدل إطلاق النار وشكل المسامير. قارن تلك بالأمثلة النموذجية الواردة في الشكل 1. بشكل عام ، تظهر النوى الكثيفة ارتفاعا سريعا ومستمرا على عدة خطوات ظهرية بطنية ، بينما تظهر الهياكل الغنية بالألياف معدلات إطلاق منخفضة ونشاط ارتفاع أقل تجانسا في الخطوات البطنية اللاحقة.
7. بالنسبة للمسار فائق المباشرة ، تأكد من أن القطب البطني موجود داخل STN.
   ملاحظه: يتم الوصول إلى STN عندما يتم الكشف عن زيادة كبيرة في MUA بطنية في Zona incerta. بطني إلى STN ، يتوقف الارتفاع تماما تقريبا لأن القطب قد وصل إلى الكبسولة الداخلية. عندما يكون القطب البطني في STN ، فإن تكوين الأقطاب الكهربائية الدقيقة للتنغستن يضمن وجود القطب الخلفي الثاني في SNr. قد يكون الضبط الدقيق للظهر البطني بزيادات صغيرة ضروريا لتسجيل MUA النموذجي في STN و SNr في نفس الوقت. لاحظ أن تواتر MUA يعتمد على عدد الخلايا العصبية المسجلة بالفعل وعلى مستوى تنشيط الدماغ.
8. بمجرد أن تكون الأقطاب الكهربائية في الهياكل المرغوبة ، قم بإعداد التصفية والفرز عبر الإنترنت (انظر الشكل 2) ، ثم ابدأ في تسجيل البيانات. تظهر الأمثلة النموذجية لحالات المزامنة القشرية المختلفة التي يمكن تحديدها في تسجيلات LFP في الشكل 3.

الجدول 1: الإحداثيات التجسيمية لتسجيل مسار العقد القشرية القاعدية شديدة المباشرة. يتم قياس جميع النقاط من نقطة مرجعية بريجما على الجمجمة بالمليمتر. غير قابل للتطبيق.

إحداثيات من بريجما STN SNr م1 المرجع 1 المرجع 2 الأمامي الخلفي -3.6 -4.8 +3.0 -10.0 -10.0 الإنسي الجانبي +2.5 +2.5 +3.0 +3.0 -3.0 الظهرية البطنية -8.0 ن. أ. ن. أ. ن. أ. ن. أ.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: نشاط مميز متعدد الوحدات من مسار القطب الكهربي الظهري البطني الذي يستهدف STN. (أ) تسجيلات متعددة الوحدات لنواة المهاد الخلفي الإنسي البطني (VPM) ، والمنطقة المنشأة (ZI) ، والنواة تحت المهاد (STN) ، والجوهر الأسود الشبكي (SNr). يظهر VPM طفرات عالية السعة متناثرة وغير منتظمة. يتوقف هذا النمط من المسامير عند الاقتراب من ZI. عندما يدخل القطب الكهربائي إلى STN ، يمكن ملاحظة نمط إطلاق نم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Ag / AgCl أقطاب فوق الجافية المخصصة Goodfellow GmbH
D-61213 باد نوهايم ، ألمانيا
info@goodfellow.com معرف المنتج AG005127 للأسلاك الفضية بنسبة 99.99٪ ستسمح أقطاب Ag / AgCl بجودة إشارة أفضل ، ولكن لا يمكن استخدامها إلا في التجارب الحادة. الاستبدال المحتمل: أقطاب كهربائية من الفولاذ المقاوم للصدأ حامل تجسيمي مع كتلة أكريليك ديفيد كوبف للأدوات ،
7324 شارع إلمو ، توجونجا ، كاليفورنيا 91042 ، الولايات المتحدة الأمريكية معرف المنتج موديل 1770 حامل القطب القياسي تأكد من أن كتلة الأكريليك بها تجاويف تناسب إعداد القطب الكهربائي للهدف المطلوب. يمكن تعديل كتل الأكريليك بسهولة باستخدام ملف للحصول على التكوين المطلوب. الاستبدال المحتمل: حاملات أقطاب كهربائية ذاتية الصنع أقطاب التنغستن microwire مقاومة 1.5 MΩ Microprobes.com< / > 18247-D فلاور هيل واي جيثرسبورغ ، ماريلاند ، 20879 الولايات المتحدة الأمريكية معرف المنتج WE3ST31.5A5-250um 1.5 MΩ ضروري لتسجيل MUA و LFP في نفس الوقت. الاستبدال المحتمل: يمكن استخدام أقطاب كهربائية دقيقة من مواد مختلفة. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية مستقيمة وقوية ورقيقة قدر الإمكان. أداة محاذاة الفئران ديفيد كوبف للأدوات ،
7324 شارع إلمو ، توجونجا ، كاليفورنيا 91042 ، الولايات المتحدة الأمريكية معرف المنتج موديل 944 أداة محاذاة الفئران يسمح للاتجاه الدقيق للدماغ بمطابقة الأطالس التجسيمية. الاستبدال المحتمل: حامل التجسيم مع قنية أكريليك أسنان مكون من عنصرين شركة أسوشيتد لمنتجات طب الأسنان المحدودة
كيمدنت ووركس ، بورتون ، سويندون
ويلتشير ، SN5 4HT ، المملكة المتحدة سيمبكس رابيد بودرة شفافة 225 جرام ، رمز المنتج: ACR803 ؛ سيمبلكس سائل سريع 150 مل، رمز المنتج: ACR920 اعتمادا على الأقطاب الكهربائية المستخدمة ، قد يكون الغراء الفائق بديلا سهلا ، إذا كانت الأقطاب الكهربائية صغيرة وخفيفة الوزن. الاستبدال المحتمل: Superglue (قائم على Cyanacrylate) قفص فاراداي البناء الذاتي سيكون قفص فاراداي المناسب هو أفضل حماية من القطع الأثرية الكهرومغناطيسية ، ولكن كل ما يمكن تشكيله على شكل صندوق أو تطبيقه على إطار ومصنوع من مادة موصلة قد يساعد. الاستبدال المحتمل: رقائق الألومنيوم أو شبكة النحاس إعداد الفيزيولوجيا الكهربية مع برنامج التسجيل وإمكانيات الفرز عبر الإنترنت نظام الحصول على البيانات العصبية OmniPlex®
شركة Plexon
6500 شارع جرينفيل ، جناح 700
دالاس ، تكساس 75206
الولايات المتحدة الأمريكية يعد برنامج الفرز دون اتصال بالإنترنت بديلا محتملا ، ويمكن العثور على العديد من البرامج النصية والبرامج مجانا في مجتمع المصدر المفتوح.