التسجيل البصري للنشاط العصبي في شرائح الدماغ الملطخة بصبغة حساسة للجهد

الملخص

المصدر: Tominaga، Y.، et al. التسجيل البصري أحادي الفوتون واسع المجال في شرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد.

يوضح هذا الفيديو إجراء لمراقبة التغيرات في النشاط العصبي في شريحة دماغية ملطخة بصبغة حساسة للجهد. تعكس الصبغة التغيرات في إمكانات غشاء الخلايا العصبية عن طريق تغيير شدة التألق. من خلال تطبيق المحفزات الكهربائية وتقنيات التصوير المتقدمة ، تتيح هذه العملية التتبع البصري للتغيرات في الوقت الفعلي في إمكانات الغشاء العصبي بناء على مضان VSD.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. التحضير اليومي للجهاز التجريبي

1. قم بتشغيل مكبر الصوت والكمبيوتر ونظام الكاميرا ، وتحقق من تشغيل البرنامج.
2. ضع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) في أنبوب سعة 50 مل وقم بفقاعة مع الكربوجين.
3. استخدم مضخة تمعجية لتدوير ACSF. اضبط معدل التدفق على حوالي 1 مل / دقيقة.
4. اضبط ارتفاع ماصة الشفط بحيث يكون مستوى السائل داخل غرفة التجربة ثابتا دائما.
   ملاحظه: مستوى الحل مهم للحصول على تسجيل مستقر ، لذلك يجب أن يتم التعديل باستخدام معالج دقيق.
5. قم بتثبيت القطب الأرضي المكون من رقاقة صفراء مملوءة ب 3 M KCl أجار (2٪) في حامل بسلك Ag-AgCl بكمية صغيرة من محلول 3M KCl.
6. املأ كمية صغيرة من ACSF (حوالي ثلثي الحجم) في القطب الزجاجي (قطر خارجي 1 مم، قطر داخلي 0.78 مم يتم سحبه باستخدام مجتذب ماصة دقيقة) باستخدام طرف أصفر رفيع مدبب وضعه في حامل القطب.
7. قم بتوصيل الحامل بالقضيب المثبت في المناور. تأكد باستخدام مكبر للصوت من أن مقاومة القطب الكهربائي تبلغ حوالي 1 MΩ.
   ملاحظه: يجب أن يكون القطب الكهربائي من نوع التصحيح ذو الفتحة العريضة الطويلة (4-8 ميكرومتر) جيدا للتسجيل الميداني وكقطب كهربائي محفز.

2. بدء جلسة تسجيل

1. خذ شريحة مستحضرة من الحجرة الرطبة بالملقط.
2. ضع الشريحة بسرعة في غرفة تجريبية تحت المجهر (الشكل 1).
3. ادفع حافة الحلقة بقوة في حلقة O المصنوعة من السيليكون. احرص على عدم كسر الغشاء أو الجزء السفلي من غرفة التجربة.
   ملاحظه: يجب أن يؤخذ اتجاه الشريحة في الاعتبار فيما يتعلق باتجاه الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل في مجال الرؤية. يجب أن تلتصق الشريحة السليمة بمرشح الغشاء حتى لا تكون هناك حاجة لاستخدام أجهزة أخرى لإصلاح الشرائح مثل الأوزان وشبكات النايلون.
4. ضع طرف القطب الكهربائي المحفز وقطب تسجيل جهد المجال على الشريحة الموجودة أسفل المجهر بالضوء المنقول.
5. استخدم نظام التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للتحقق من الاستجابة. تأكد من التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المعتاد (غير الملطخ) بتكوين معين.
   ملاحظه: يمكن حذف قطب التسجيل ولكنه مفيد للتحقق من فسيولوجيا الشريحة.
6. اضبط شدة ضوء الإثارة على حوالي 70-80٪ من السعة القصوى في الكاميرا التي تتوافق مع 13-15 ميجاواط / سم² في العينة عند أخذ العينات عند 10 كيلو هرتز باستخدام عدسة موضوعية بالغمر في الماء 5x وعدسة أنبوبية PLAN APO 1x. يبلغ الطول الموجي لضوء الإثارة 530 نانومتر ، ويجب أن يكون مرشح الانبعاث > 590 نانومتر
   ملاحظه: استخدم غالقا لتقليل كمية ضوء الإثارة. قد يؤدي التعرض المستمر للضوء إلى تدهور فسيولوجيا الشرائح. يعتمد التأثير الضار المحتمل للضوء على شدة الضوء ومدته. استخدم التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للحكم على تأثير الضوء. في حالة قوة 13-15 ميغاواط / سم² ، يجب أن يكون التعرض حوالي 1 ثانية هو الحد الأعلى للتسامح.
7. اضبط التركيز باستخدام نظام الاستحواذ باستخدام مصدر ضوء الفلورسنت لأن التركيز قد يكون مختلفا اعتمادا على الطول الموجي وابدأ الاستحواذ.
8. افحص البيانات في برنامج الحصول على الصور.
   ملاحظه: استخدمنا حزمة البرمجة الدقيقة الأصلية لبرامج التحليل العددي للتحليل التفصيلي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. نظام تسجيل الإشارات الضوئية من الاستعدادات الشريحة. (أ) صورة للمجهر المستخدم لتصوير الشرائح في المخطوطة الحالية. تتكون البصريات من عدسة موضوعية (5x NA0.60) ، وصندوق مرآة للمرشح ثنائي اللون (580 نانومتر) ، وعدسة إسقاط (أنبوب) (PLAN APO x1.0). يتم توصيل كاميرا عالية السرعة في الجزء العلوي من عدسة الإسقاط من خلال حامل c. هناك كاميرا USB أخرى معتادة للمراقبة. يتم إدخا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام الحصول على الصور عالي السرعة شركة Brainvision المحدودة ميكام - ألتيما نظام التصوير نظام الحصول على الصور عالي السرعة شركة Brainvision المحدودة ميكام 02 نظام التصوير Macroscepe للتصوير الميداني الواسع شركة Brainvision المحدودة منظار THT منظار كبير نظام إضاءة LED عالي الدقة مع مثبط الصمام الثنائي للصور شركة Brainvision المحدودة ليكس-2 جي إضاءة LED برنامج الحصول على الصور شركة Brainvision المحدودة BV-آنا برنامج الحصول على الصور محفز كهربائي متعدد الوظائف شركة Brainvision المحدودة ESTM-8 عازل التحفيز + محول AD / DA مرشح غشاء لدعم الشريحة ميرك ميليبور المحدودة ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية أومنبور ، JHWP01300 ، 0.45 ميكرومتر المسام ، مرشح الغشاء/ 0.45 13 برنامج التحليل العددي شركة Wavemetrics Inc. ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية إيجوربرو تحليل البرامج عازل التحفيز شركة WPI أ 395 عازل التحفيز محول AD / DA إنستروتيك مركز التجارة الدولية-18 محول AD / DA صبغة حساسة للجهد Di-4-ANEPPS Invitrogen ، Thermo-Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية رقم الفهرس: D-1199 VSD: Di-4-ANEPPS زيت الخروع متعدد الإيثوكسيلات سيجما ألدريتش كريموفور EL C5135 زيت الخروع متعدد الإيثوكسيلات