تسجيل مشبك التصحيح المثقوب للخلايا العصبية الحسية الشمية في الفئران

الملخص

المصدر: Jarriault, D., et al. تسجيل مشبك رقعة مثقبة للخلايا العصبية الحسية الشمية للفأر في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي للخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات رائحة محددة. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) في الفئران باستخدام تقنية مشبك التصحيح المثقوب. يتم عزل الظهارة الشمية ، التي تحتوي على OSNs مع مستقبلات رائحة تحمل علامات الفلوروفور ، عن الفأر وتثبيتها في غرفة التسجيل. يتم تثبيت ماصة التسجيل على المقبض الشجيري ل OSN، ويقوم النيستاتين داخل الماصة بثقب الغشاء لتكوين اتصال كهربائي بالخلية. أخيرا ، يتم استخدام ماصة أخرى لتوصيل منشط للرائحة ، ويتم تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلية المرقعة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1.

1. استخدم الفئران المعدلة وراثيا OR-IRES-tauGFP (أو = المستقبلات الشمية ، IRES = موقع دخول الريبوسوم الداخلي ، tauGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر تاو) المتوفرة في مختبر جاكسون. تم تطوير هذه الفئران في مختبر الدكتور بيتر مومبارتس من أجل تحليل استهداف المحاور وتطوير نظام حاسة الشم. على سبيل المثال ، يحمل خط MOR23-IRES-tauGFP ، رقم المخزون 006643 ، اسم السلالة الرسمي B6. 129P2-Olfr16tm2Mom / MomJ ؛ وبالمثل ، فإن خط SR1-IRES-tauGFP ، رقم السهم 6717 يحمل الاسم الرسمي B6 ؛ 129P2-Olfr124tm1Mom/MomJ.
2. فيما يتعلق بعمر: للحصول على نتيجة أفضل للبروتوكول ، استخدم التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أسابيع. في هذه الفئة العمرية ، يكون التشريح أسهل (عظام أكثر ليونة ، ظهارة شمية أكثر صلابة) والمقابض التغصنية أكبر مقارنة بالحيوانات الأكبر سنا.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الأقطاب الكهربائية والمحاليل

1. بالنسبة للماصات المحفزة: قم بشراء ماصات محفزة مسحوبة مسبقا. خلاف ذلك ، قم بإعدادهم يدويا.
   1. باستخدام اللهب ، قم بثني ست ماصات زجاجية مقاس 1 مم على بعد حوالي 1 سم من الحافة. أدخل هذه الماصات الست بالإضافة إلى أنبوب مستقيم 7 في 1.5 سم مقاوم للانكماش الحراري معزز بثقب.
   2. تعمل الحرارة على تقليص الأنبوب للحفاظ على البراميل متصلة ببعضها البعض. قم بتوصيل أنبوب إضافي للانكماش الحراري بالطرف الآخر من البراميل. اسحب هذه الماصة المحفزة باستخدام مجتذب متعدد الأسطوانة.
   3. أضف بعض الغراء السائل الأبيض حول الثقب لتقوية الأطراف المنحنية. اتركه يجف طوال الليل (O / N).
2. قم بإعداد 1 أو 2 لتر من محلول Ringer العادي خارج الخلية (بالملليمتر: كلوريد الصوديوم 124 ، KCl 3 ، MgSO₄ 1.3 ، CaCl₂ 2 ، NaHCO₃ 26 ، NaH₂PO₄ 1.25 ، الجلوكوز 15 ؛ درجة الحموضة 7.6 و 305 mOsm). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. تحضير محلول مخزون داخل الخلايا (بالمللي مولار): KCl 70 ، KOH 53 ، حمض ميثان سولفونيك 30 ، حمض رباعي الأسيتيك جلايكول الإيثيلين (EGTA) 5 ، 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) 10 ، السكروز 70 ؛ درجة الحموضة 7.2 (KOH) و 310 مللي أسم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جيد لعدة أسابيع.
4. قم بإعداد محلول التسجيل داخل الخلايا باستخدام النيستاتين بشكل مؤقت (في اللحظة الأخيرة) قبل التجربة.
   1. تزن 3 ملغ من النيستاتين ، أضف 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ؛ دوامة 20 ثانية ثم صوتنة 2-3 دقائق حتى تضعف تماما.
   2. أضف 20 ميكرولتر من محلول DMSO-nystatin في 5 مل من محلول المخزون داخل الخلايا. دوامة 20 ثانية ، ثم صوتنة 3 دقائق. احتفظ بهذا المحلول عند 4 درجات مئوية واحميه من الضوء المباشر ، والنيستاتين حساس للضوء. يمكن استخدام هذا الحل لبضع ساعات. استبدل كل يوم.
   3. بمجرد أن يصبح مستحضر الظهارة الشمية تحت المجهر ، خذ بعضا من هذا المحلول في حقنة سعة 1 مل بطرف أصفر ممدود باللهب لملء الأقطاب الكهربائية ؛ حماية من الضوء المباشر. بمجرد وصوله إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، يكون محلول النيستاتين غير مستقر. استبدل المحلول في حقنة 1 مل كل ساعة أو احتفظ به في الثلج.
5. اسحب أقطاب التسجيل باستخدام مجتذب للحصول على رقبة طويلة وطرف صغير (~ 2 ميكرومتر) بمقاومة 15-20 MΩ بمحلول النيستاتين الداخلي.
6. تحضير محلول الرائحة على ارتفاع 0.5 متر في DMSO تحت غطاء الدخان ؛ aliquot وحفظ في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. خفف الرائحة في محلول رينجر حتى التركيز المطلوب. املأ الماصة المحفزة.

فئة < ص = "jove_title" >3. تحضير الظهارة الشمية

ملاحظة: تعبر الفئران OR-IRES-tauGFP عن tauGFP تحت سيطرة مروج OR. في هذه الفئران ، يتم تصنيف جميع الخلايا العصبية التي تعبر عن OR ذات الأهمية ب GFP. تم تكييف هذا البروتوكول مع الموارد الأخرى المعبر عنها في جميع المناطق. ومع ذلك ، فإن التشريح والتسجيلات أسهل بالنسبة للغرف المعبر عنها في المنطقة الظهرية.

1. تخدير عن طريق حقن مزيج من الكيتامين والزيلازين (150 ملغم/كغ و10 ملغم/كغ من وزن الجسم على التوالي). يمكن إجراء قطع الرأس بمقص حاد للفئران الصغيرة أو باستخدام مقصلة القوارض التي يتم صيانتها بشكل صحيح للفئران الأكبر سنا.
   1. باستخدام مقص تشريح الحلقة ، قم بعمل شق وسطي طولي عبر الجلد الظهري. قم بإزالة الجلد عن طريق فصله. باستخدام المقص ، قم بقص الفكين السفليين عند مفصل الفك. قم بإزالة الأسنان الأمامية العلوية عن طريق قطع إكليلي مواز للأسنان.
   2. قم بعمل قطع إكليلي للرأس خلف العينين واحتفظ فقط بالجزء الأمامي من الرأس. اغمسها في محلول Ringer مثلج للتشريح تحت النطاق.
2. تشريح تحت النطاق: في الجانب البطني ، قم بعمل قطع طولي على طول الفك العلوي / الأسنان. قطع العظام الظهرية طوليا ، باتباع الجانب الظهري الجانبي من تجويف الأنف. إزالة معظم العظام والحنك. نقل الحاجز والظهارة المرفقة به في Ringer المؤكسج في RT.
3. للتشريح النهائي: قبل بدء جلسة التسجيل مباشرة ، انزع الظهارة من الحاجز الأساسي باستخدام الملقط. افصل الظهارة بالملقط وبقطعتين مقصتين مقاس 4-5 مم (استخدم مقص الفانات الدقيقة) في الجزء الأمامي من الحاجز حيث يكون الالتصاق أقوى.
   1. قم بإزالة العضو الصوتي بعناية عن طريق قطعه على طول اتصاله الظهري بظهارة الحاجز. نقل الظهارة إلى غرفة التسجيل بحيث تكون الطبقة المخاطية متجهة لأعلى. احتفظ بها مسطحة في الغرفة باستخدام القيثارة.
4. قم بتثبيت الغرفة تحت مجهر عمودي مجهز ببصريات مضان وكاميرا حساسة. تصور التحضير على شاشة الكمبيوتر بتكبير عال من خلال هدف الغمر في الماء 40X (فتحة العدسة العددية 0.8) وتكبير إضافي 2X أو 4X يتم تحقيقه بواسطة عدسة مكبرة. قم بتشغيل الرنجر المؤكسج بشكل مستمر عند RT (1-2 مل / دقيقة).

4. جلسة التسجيل

1. البحث عن الخلايا الفلورية: قم بإثارة المستحضر عند 480 نانومتر ل EGFP ، الذي ينبعث منه الضوء في نطاق 530-550 نانومتر ؛ استهدف مقبضا شغنيا واحدا يمكن رؤيته بشكل موثوق في التألق وتحت المجال الساطع.
2. املأ القطب بمحلول داخل الخلايا بالنيستاتين ؛ قم بإزالة الفقاعات عن طريق النقر برفق على القطب.
3. أدخل قطبا كهربائيا على حامل القطب ، واضغط على الضغط الإيجابي في الماصة ؛ يجب أن تكون المقاومة 15-20 MΩ.
4. قم بتقريب القطب الكهربائي من الخلية ؛ بمجرد أن تصل المقاومة إلى ~ 40 MΩ ، حرر ضغطا إيجابيا وقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف للوصول إلى gigaseal.
5. بمجرد الوصول إلى الختم ، اضبط إمكانات الغشاء عند حوالي -75 مللي فولت ؛
6. بمجرد فتح الخلية ، تابع بروتوكولات التحفيز والعلاجات الدوائية. لقياس الاستجابة لتحفيز رائحة واحد ، سجل 200-500 مللي ثانية من النشاط التلقائي ، وقم بالتحفيز لمدة 500 مللي ثانية وقياس استجابة الخلية لمدة تصل إلى 10 ثوان. بالنسبة للعلاجات الدوائية ، قم ببث العوامل الدوائية بالتركيز المطلوب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المعدات الثقيلة طاولة اهتزاز مع قفص فاراداي TMC سلسلة 63-500 مطلوب : يعزل نظام التسجيل عن الاهتزازات التي تسببها البيئة (حركات المجرب ، اهتزازات المعدات مثل مراوح تبريد أجهزة الكمبيوتر ، إلخ) ؛ يمكن أيضا شراؤها بقفص فاراداي ، أو مجهزة بقفص فاراداي مصنوع خصيصا ؛ يوصى بهذا القفص لتجنب الضوضاء الكهربائية من البيئة البصريات مجهر أوليمبوس BX51WI مغرفة مجهرية منتصبة مجهزة بالتألق السطحي ؛ مرحلة ثابتة أو متحركة حسب تفضيل المستخدم اهداف أوليمبوس LUMPLFL40XW مطلوب هدفين على الأقل: 4X أو 10X للنهج الخشن للخلية ؛ ومثال الغمر لمسافات طويلة 40X Olympus LUMPLFL40XW / IR / 0،8 / WD: 3.3 مم مكبّر أوليمبوس يو تي في سي إيه سي سي مطلوب للغاية: يوضع في مسار الضوء بين الهدف والكاميرا ؛ يسمح بتكبير الصورة على الشاشة من أجل الوصول بدقة إلى المقبض باستخدام قطب التسجيل كاميرا أوليمبوس موانئ دبي 72 مطلوب كاميرا جيدة لرؤية الخلايا العصبية في التألق وكذلك في المجال الساطع ؛ برنامج التحكم بسيط ويسمح بالتقاط الصور وعمل صورة كاميرا حية لمراقبة اقتراب القطب من الخلية. الكاميرا فائقة الحساسية ليست ضرورية مرشحات أوليمبوس / كروما اعتمادا على البروتين الفلوري المستخدم في الفئران ؛ مثال على GFP: الإثارة: BP460-490: الانبعاث: HQ530 / 50m تسجيل الأقطاب الكهربائية / النظام مكبر هيكا EPC10 USB يراقب التيارات المتدفقة عبر قطب التسجيل ويتحكم أيضا في النفخ عن طريق إرسال إشارة TTL إلى الرشاش ؛ إعداد EPC10 هو
تسيطر عليها الكمبيوتر برمجيات هيكا باتش ماستر يتحكم في مكبر الصوت أثناء التجربة مناور دقيق سوتر MP225 مناور دقيق دقيق ، يسمح بحركات دقيقة تصل إلى 1/10 ميكرومتر ؛ هذا النموذج مستقر للغاية ؛ تجنب المتلاعبين الهيدروليكيين الذين قد ينجرفون مجتذب القطب الكهربائي سوتر ص 97 مع خيوط الحوض العريضة FT345-B ؛ لإعداد ماصات تسجيل بقطر حوالي 2 ميكرومتر مع طرف طويل للوصول إلى الخلايا ؛ يجب أن تكون المقاومة من 15 إلى 20 موهم مع محلول مشبك التصحيح المثقب زجاج سوتر BF120-69-10 في ظروف التسجيل لدينا ، يعد هذا الزجاج مثاليا لتسجيل الماصات غرفة التسجيل وارنر إنسترومنتس RC-26G هناك حاجة إلى غرفة لضبط المستحضر تحت المجهر. للحفاظ على المستحضر في وسط الغرفة ، يجب استخدام شبكة / مرساة. التحفيز زجاج WPI TW100F-4 يتم إرفاق هذه الماصات في مجموعات من 7 ، وتستخدم لتحضير ماصات محفزة مسبقة السحب مجتذب متعدد الماسورة MDI PMP-107-Z من خلال الارتباط بالسحب والالتواء ، يسمح لنا هذا المجتذب بإعداد أقطاب كهربائية مع 7 براميل حاقن ضغط دقيق شركة توهي P / N T25-1-900 قناة واحدة يتحكم حاقن الضغط الدقيق هذا في الضغط المقذوف في مجتذب متعدد الماسورات ؛ يتم التحكم فيه يدويا أو بواسطة مكبر الصوت بواسطة 5V TTLs مناور دقيق ناريشيجي أنت-1 يكفي مناور خشن لتقريب قطب النفخ من موقع التسجيل الأنابيب المحاليل / التروية / المواد الكيميائية مضخة فراغ غاردنر دنفر نظام التروية غير متاح غير متاح نيستاتين سيجما ألدريتش N3503 إلزامي لحل داخلي لتثبيت مشبك التصحيح المثقوب ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش د5879 تستخدم لحل النيستاتين للحل الداخلي للتصحيح المثقوب كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S9625 حل خارج الخلية كلوريد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 4504 محلول داخل الخلية / خارج الخلية ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش [ك7902] حل خارج الخلية أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH₂PO₄) سيجما ألدريتش إس 9638 حل خارج الخلية كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO₄ 7H₂O) سيجما ألدريتش 63140 [م] حل خارج الخلية الجلوكوز سيجما ألدريتش G8270 حل خارج الخلية بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش إس 6297 حل خارج الخلية EGTA (الإيثيلين جلايكول مكرر (2- أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N ′- حمض التترا أسيتيك) سيجما ألدريتش E3889 الحل الداخلي هيدروكسيد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 1767 الحل الداخلي سلفوكسيد الميثيل سيجما ألدريتش W387509 حل داخل الخلايا هيبس نا سيجما ألدريتش H7006 حل داخل الخلايا سكروز سيجما ألدريتش S0389 حل داخل الخلايا