تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. محاذاة المسار البصري بين كاميرا CMOS (أشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعدن) وسلك التصحيح الفردي أو المتفرع
- قم بفك جميع البراغي الموجودة على المترجم ذو 5 محاور (الشكل 1 ب).
- قم بربط سلك التصحيح (الشكل 1 ب) بالمحول [SMA (موصل الألياف البصرية الفرعي المصغر A) أو FC (موصل الألياف البصرية)] المثبت على المترجم ذو 5 محاور.
- قم بتشغيل ضوء الإثارة 470 نانومتر (الشكل 1 ب) بطاقة منخفضة (100 ميكروواط) وضع طرف سلك التصحيح مشيرا إلى شريحة بلاستيكية ذاتية الفلورسنت. هذا ليس له أي تأثير على التسجيلات المستقبلية ولكنه مخصص فقط لتصور عملية المحاذاة.
- سجل من كاميرا CMOS (الشكل 1 ب) في الوضع المباشر. قم بزيادة الكسب أو اضبط جدول البحث (LUT) حتى لا تصبح الصورة سوداء بالكامل. النقطة المهمة هي أن تكون قادرا على رؤية صورة في النقطة المحورية للهدف (الشكل 1 ب).
- تقدم المترجم ذو 5 محاور نحو الهدف ، مع التأكد من أن ضوء 470 نانومتر يتركز على الألياف في نهاية SMA أو FC لسلك التصحيح حتى يمكن حل الصورة على الكاميرا.
- اضبط المحورين X وY حتى يتم توسيط الصورة وحلها جيدا.
- تصور الضوء المنبعث من نهاية الطويق لسلك التصحيح. يجب أن تظهر كدائرة متناحية. إذا تم استخدام سلك تصحيح متفرع ، فيجب أن تكون كمية الضوء المنبعثة من نهايات الطويق لكل سلك تصحيح متشابهة. إذا لم تكن الدائرة متناحية، أو كان الضوء المنبعث غير متساو، فاضبط المترجم ذو 5 محاور في المحور XY.
فئة
2. إعداد عائد الاستثمار حول الألياف لقياس متوسط شدة الفلورسنت
- قم بتشغيل جميع أضواء الإثارة لتصور الألياف بشكل أفضل. اضبط كسب الكاميرا بحيث لا تكون وحدات البكسل مشبعة وتوجد صورة واضحة للألياف.
- سجل مباشر أو التقط صورة أولية.
- ارسم عائد استثمار حول الألياف واحتفظ بها لقياس متوسط قيم الشدة أثناء التسجيلات (الشكل 1 أ).
- بالنسبة لتسجيلات الألياف المتعددة، اختبر استقلالية الإشارات.
- سجل حي من جميع الألياف.
- وجه أليافا واحدة نحو مصدر الضوء واضغط بإصبعك. وينبغي أن تحدث تقلبات كبيرة في تلك القناة وحدها (التسرب المقبول 1:1000).
- إذا لم تكن الإشارات مستقلة ، فأعد رسم عائد استثمار أكثر تحفظا وكرر اختبار الاستقلالية.
- لتسمية وتتبع عائد الاستثمار الذي يتوافق مع الألياف أو الشريط الملون أو طلاء الأظافر الذي يمكن تطبيقه في نهاية الألياف. التقط صورة قبل بدء أي تجربة كتذكير ثانوي.
3. إعداد ساحة التسجيل
- قم بتعليق سلك التصحيح فوق الساحة باستخدام الحوامل أو المشابك أو الحوامل.
- تأكد من أن يمكنه التحرك بحرية في جميع أنحاء الساحة بأكملها ، دون أن يعيقه طول الألياف.
- إذا تم استخدام صندوق تشغيل أو حقل مفتوح ، فتأكد من وصول سلك التصحيح إلى بأقل قدر من الانحناء. إذا تطلب ذلك كزة الأنف ، فتأكد من وجود مساحة كافية لمنع ثني الألياف. تجنب أي انحناء أو التواء مفرط لسلك التصحيح.
4. تسجيلات في الجسم الحي
- افحص بصريا الطرف البعيد لألياف سلك التصحيح بالعين وباستخدام مجهر من الألياف الصغيرة. إذا تم خدش سطح الألياف ، فقم بإعادة تلميع الألياف باستخدام فيلم تلميع / لف الألياف بحبيبات دقيقة (1 ميكرومتر و 0.3 ميكرومتر).
- نظف الأطراف البعيدة لسلك التصحيح باستخدام 70٪ من الإيثانول وقضيب طرف قطني.
- نظف قنيات الألياف الضوئية باستخدام 70٪ من الإيثانول وقضيب طرف قطني.
- قم بتوصيل الطرف الطويقي لسلك التصحيح بالألياف المزروعة باستخدام غلاف منقسم من السيراميك مغطى بأنبوب انكماش أسود. تأكد من إحكام الغلاف أثناء التوصيل. خلاف ذلك ، استخدم كم جديد.
ملاحظه: إذا كان هناك أي مسافة بين طويق سلك التصحيح والغرسة ، فسيكون هناك قدر كبير من فقدان الإشارة ، ولن تعمل التسجيلات.
- اسمح للحيوان بالتعافي لبضع دقائق قبل بدء الاختبار السلوكي.
- ابدأ في تسجيل الإشارة الضوئية وقم بتشغيل التجربة.
- أثناء التسجيل ، راقب بعناية التتبع المباشر لضمان جودة التسجيلات. من المتوقع أن تنخفض الإشارة بسرعة كدالة للوقت في أول دقيقتين من التسجيل. يحدث هذا التأثير بسبب اضمحلال LED بوساطة الحرارة ، حيث تزيد الزيادة في الحرارة من مقاومة العنصر البصري.
- في حالة حدوث قفزة في الإشارة تتجاوز حركية التشغيل / الإيقاف في GCaMP ، فغالبا ما يشير هذا إلى أن الغلاف ليس ضيقا بدرجة كافية وأن المسافة بين سلك التصحيح والزرع تتغير. في هذه الحالة ، أوقف التجربة وأعد توصيل باستخدام غلاف جديد.
