دراسة الفيزيولوجية الكهربية للمشابك الشبكية والكورتيكوجينيكولات في شرائح دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Chen, X., et al. التحقيقات الفيزيولوجية الكهربية لوظيفة المشبك الشبكي والكورتيكوجينيكولات. J. Vis. Exp. (2019).

يصف الفيديو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للمشابك الشبكية والكورتيكوموليكولات في شرائح دماغ الفأر. يتم وضع الشرائح التي تحتوي على النواة الركبية الجانبية الظهرية (dLGN) في غرفة التسجيل. يتم وضع ماصة محفزة إما على الجهاز البصري لتحفيز الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) والتحقيق في المشابك الشبكية أو المهاد الشبكي للنواة لتحفيز الخلايا العصبية القشرية والتحقيق في المشابك القشرية. عند التحفيز ، تطلق RGCs والخلايا العصبية القشرية ناقلات عصبية مثيرة ، والتي تنتج تيارات متشابكة في الخلايا العصبية لترحيل LGN. يتم تسجيل هذه التيارات باستخدام ماصة تسجيل مشبك التصحيح.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. الحلول

1. محلول التشريح
   1. للحد من السمية المثيرة, إعداد حل على أساس الكولين لاستخدامها أثناء تشريح كما هو معروض هنا (في مل): 87 كلوريد الصوديوم, 2.5 كيلولار, 37.5 كلوريد الكولين, 25 هيدروكسيد_{الصوديوم 3}, 1.25 هيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄, 0.5 كلوريد الكالسيوم₂, 7 ملغ كلوريد₂, و 25 الجلوكوز. تحضير محلول التشريح قبل أقل من أسبوع من التجربة.
2. حل التسجيل
   1. تحضير محلول السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (ACSF) يحتوي على (بالملليمتر): 125 كلوريد الصوديوم ، 25 NaHCO₃ ، 1.25 NaH₂PO₄ ، 2.5 KCl ، 2 CaCl₂ ، 1 MgCl₂ ، و 25 جلوكوز. أضف 50 ميكرومتر من حمض D-2-Amino-5-phosphonovaleric (D-APV) و 10 ميكرومتر SR 95531 هيدروبروميد (جابازين) لمنع مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDA) و GABAA ، على التوالي.
3. محلول داخل الخلايا
   1. تحضير محلول داخل الخلايا يحتوي على (بالمللي مولار): 35 Cs-gluconate و 100 CsCl و 10 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبرازينات إيثان سلفونيك (HEPES) و 10 حمض إيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك (EGTA) و 0.1 D-600 (ميثوكسي فيراباميل هيدروكلوريد). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام CsOH. قم بتصفية محلول المرق وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تشريح

1. قم بإعداد غرفتين للشرائح ، إحداهما مملوءة ب 100 مل من محلول التشريح والأخرى ب 100 مل من محلول التسجيل. ضع الكوبين في حمام مائي (37 درجة مئوية) وقم بغلي المحاليل بالكربوجين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التشريح.
2. املأ دورق بلاستيكي ب 250 مل من محلول التشريح القريب من المثلج (ولكن غير المجمد). فقاعات مع الكربوجين قبل 15 دقيقة على الأقل من الاستخدام.
3. املأ طبق بتري بلاستيكي (100 مم × 20 مم) ، حيث سيتم إجراء تشريح الدماغ ، بمحلول التشريح البارد. ضع قطعة من ورق الترشيح في غطاء طبق بتري.
4. قم بتبريد غرفة تشريح الاهتزاز.
5. تخدير الفأر بنسبة 2.5٪ من الأيزوفلوران ، على سبيل المثال ، في قفص الفأر. بمجرد أن لا يستجيب الفأر لقرصة الذيل ، اقطع رأس الفأر بالقرب من النخاع العنقي واغمر الرأس في محلول التشريح المثلج البارد في قاعدة طبق بتري.
6. اقطع جلد الرأس من الذيلية إلى الأنف واحتفظ به بشكل جانبي بالأصابع لكشف الجمجمة. لإخراج الدماغ الأمامي ، قم أولا بقص الجمجمة جنبا إلى جنب مع خط الوسط الخلفي الأمامي ، ثم قم بقص مرتين أخريين من خلال الخيط الإكليلي وخياطة لامدويد (الشكل 1 أ).
7. قم بإزالة الجمجمة بين الخيط الإكليلي والخياطة اللامدوية بحيث ينكشف المخ. اقطع البصلة الشمية وافصل الدماغ الأمامي عن الدماغ المتوسط بشفرة رفيعة (الشكل 1 ب). أخرج الدماغ من الجمجمة بملعقة رفيعة وضعها على ورق الترشيح الموجود في غطاء طبق بتري.
   ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوتين 2.6 و 2.7 في أسرع وقت ممكن لتقليل موت الخلايا.
8. للحفاظ على سلامة المدخلات الحسية والقشرية إلى dLGN في شريحة الدماغ ، افصل نصفي الكرة الأرضية بقطع طفيلي بزاوية 3-5 درجة (الشكل 1C ، D). جفف المستويات المتوسطة الجانبية لنصفي الكرة الأرضية عن طريق وضعها على ورق الترشيح ثم ألصقها على مرحلة القطع بزاوية 10-25 درجة من المستوى الأفقي (الشكل 1E).
9. ضع المسرح في وسط الدرج المعدني العازل واسكب باقي محلول التشريح المثلج برفق في الدرج الاحتياطي. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية لأن الصب القوي قد يزيل الدماغ الملصق (الشكل 1F).
10. ضع الدرج العازل في الدرج المملوء بالثلج ، مما يساعد في الحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة أثناء التشريح. قطع شرائح 250 ميكرومتر بشفرة حلاقة بسرعة 0.1 مم / ثانية وسعة 1 مم.
11. احتفظ بالشرائح في غرفة التثبيت مملوءة بمحلول التشريح المؤكسج عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا ثم اترك الشرائح تتعافى في محلول التسجيل عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
12. بعد الاسترداد ، قم بإزالة حجرة الاحتفاظ بالشريحة من الحمام المائي واحتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تستخدم في التجارب.

< ص الفئة = "jove_title" >3. الفيزيولوجيا الكهربية

1. اسحب الماصات باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ومجتذب الفتيل. حافظ على مقاومة تسجيل الماصات عند 3-4 MΩ. اسحب الماصات المحفزة باستخدام نفس البروتوكول ولكن اكسر طرفها قليلا بعد السحب لزيادة القطر. املأ ماصات التسجيل بالمحلول داخل الخلايا والسيتين الحيوي، مع ملء الماصات المحفزة بمحلول التسجيل.
2. ضع الشرائح في غرفة التسجيل وقم ببث الشرائح باستمرار بمحلول التسجيل المؤكسج في RT. تحقق من جميع الشرائح وحدد الشرائح التي تعرض مسارا بصريا سليما.
3. تصور الشريحة والخلايا باستخدام مجهر عمودي مزود بفحص مجهر فيديو تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC><). ملاحظه: يتم تمييز الخلايا العصبية المتتابعة عن الخلايا العصبية الداخلية من خلال حجمها الأكبر والمزيد من التشعبات الأولية (الفروع الخارجة من سوما). تظهر الخلايا العصبية الداخلية مورفولوجيا ثنائية القطب مع سوما أصغر.
4. ضع الماصة المحفزة على الشريحة قبل ترقيع الخلية بماصة التسجيل. للتحقيق في نقاط الاشتباك العصبي ، ضع الماصة المحفزة مباشرة على السبيل البصري ، حيث يتم تجميع ألياف المحور العصبي من خلايا العقدة الشبكية (الشكل 2 أ). لتحليل نقاط الاشتباك العصبي القشرية ، ضع القطب المحفز على المهاد الشبكي للنواة ، والتي تكون مجاورة من الناحية الظهارية ل dLGN (الشكل 2 ب).
5. بمجرد غمر ماصة التسجيل في محلول التسجيل، قم بتطبيق خطوة جهد 5 مللي فولت لمراقبة مقاومة الماصة. اضبط إمكانات الاحتفاظ على 0 مللي فولت وقم بإلغاء إمكانات الإزاحة بحيث يكون تيار التثبيت 0 باسكال
6. اقترب من الخلية باستخدام ماصة التسجيل أثناء الضغط الإيجابي. عندما تكون الماصة على اتصال مباشر بغشاء الخلية، حرر الضغط الإيجابي، واضبط إمكانات التثبيت على -70 مللي فولت. استخدم ضغطا سلبيا طفيفا للسماح لغشاء الخلية بالالتصاق بالماصة الزجاجية بحيث يتشكل مانع تسرب جيجا أوم (المقاومة >1 GΩ). قم بتعويض سعة الماصة وافتح الخلية عن طريق تطبيق نبضات الضغط السلبي.
7. للتحقق من الوظيفة المشبكي، قم بتطبيق نبضات تيار 0.1 مللي ثانية (حوالي 30 ميكرو أمبير) عبر ماصة التحفيز. إذا لم يتم ملاحظة استجابات متشابكة، فقد يتعين استبدال الماصات المحفزة. كن حذرا أثناء وضع الماصات المحفزة في موضع مختلف بحيث لا تضيع الخلية المسجلة.
   ملاحظه: في التسجيلات النموذجية الموضحة في الشكل 2 ، تم التحقيق في اللدونة قصيرة المدى المشبكية عن طريق تحفيز السبيل البصري أو الألياف القشرية المنشأة مرتين بفواصل 30 مللي ثانية بين التحفيز. تم حساب نسبة النبض المزدوج (PPR) بقسمة سعة التيار التالي المشبكي الاستثاري الثاني (EPSC) على سعة EPSC الأول (EPSC2 / EPSC1). تم تكرار كل بروتوكول تحفيز 20 مرة. تم قياس سعة EPSC من متوسط التيارات ل 20 عملية مسح. كان الفاصل الزمني بين كل تكرار 5 ثوان على الأقل لتجنب اللدونة قصيرة المدى الناجمة عن التكرار.
8. راقب مقاومة السلسلة باستمرار عن طريق تطبيق خطوة جهد 5 مللي فولت. استخدم فقط الخلايا ذات المقاومة المتسلسلة الأصغر من 20 MΩ للتحليل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: المخططات التي تمثل بروتوكول التشريح. (أ) منظر أفقي لجمجمة الفأر ، يوضح موضع الجروح الأولية. تم إجراء القطع الأول جنبا إلى جنب مع الخيط السهمي ، تلاه قطعتان أخريان جنبا إلى جنب مع الخيط الإكليلي والخياطة اللامدوية ، على التوالي. تمثل الخطوط المتقطعة الشقوق. (ب) النظرة القوسية للدماغ كله. تشير الخطوط المتقطعة إلى أن المخ معزول عن البصلة الشمية والدم...

المواد