$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. حلول لتسجيلات الشرائح الحادة
- تحضير محاليل مخزون من محلول السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) 10x (124 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 26 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، 1 ملي هيدروهيدرات الصوديوم2PO4 ، و 11 ملي مولار D-الجلوكوز) في ماء نقي منزوع الأيونات قبل تجارب الفيزيولوجيا الكهربية. قم بتخزين المحلول في 4 درجات مئوية في زجاجة سعة 1 لتر بدون كلوريد الكالسيوم2 و MgCl2.
- تحضير محلول الماصة القائم على غلوكونات البوتاسيوم ليحتوي على 135 ملي مولار ك.غلوكونات ، 1.2 ملي كلوريد العقدة ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.2 ملي مولار EGTA ، 2 ملي ملي كلوريد2 ، 4 ملي مولار MgATP ، 0.4 ملي مولار تريس-جي تي بي ، 10 ملي سنومي 2-فوسفوكرياتين ، 2.7-7.1 ملي مولار بيويسيتين للكشف عن مورفولوجيا الخلية اللاحقة. اضبط درجة الحموضة في المحلول على 7.3 والأسمولية إلى 290 مللي أسم. قم بتخزين 1 مل من الكميات عند -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
2. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة
- انقل شريحة دماغية تحتوي على مركب الحصين برفق باستخدام ماصة نقل زجاجية مصنوعة خصيصا إلى غرفة التسجيل المثبتة على مجهر عمودي. ماصة النقل مصنوعة من ماصة باستور مختصرة (القطر الداخلي 6.5 مم) متصلة بلمبة ماصة مطاطية. قم ببث غرفة التسجيل (3 مل) باستمرار مع 34 درجة مئوية (دافئة) aCSF فقاعات بنسبة 95٪ / 5٪ O2 / CO2. اضبط سرعة المضخة التمعجية على 2-3 مل / دقيقة.
- افحص بإيجاز تعبير Chronos-GFP في أطراف المحور العصبي في المنطقة ذات الاهتمام بإضاءة LED زرقاء (470 نانومتر) وراقب بهدف 4x. يتم تصور تألق GFP من خلال مرشح انبعاث مناسب ، مع عرض صورة كاميرا CCD على شاشة الكمبيوتر.
- ضع مرساة شريحة مصنوعة من سلك بلاتيني على شكل حرف U مع خيوط نايلون متباعدة بإحكام ("القيثارة") على الشريحة للحفاظ عليها.
- قم بالتغيير إلى هدف الانغماس بمعدل 63 ضعفا واضبط التركيز. تحقق من المحاور التي تعبر عن Chronos-GFP واختر خلية عصبية هرمية لتسجيل التصحيح.
- حرك الهدف لأعلى.
- اسحب الماصات باستخدام مجتذب قطب كهربائي بني مشتعل من زجاج البورسيليكات. تم ضبط الساحب/ت لإنتاج ماصات بقطر طرف يبلغ حوالي 1 ميكرومتر. املأ الماصات بمحلول داخلي قائم على K-gluconate.
- قم بتركيب الماصة في حامل الماصة على مرحلة الرأس. اخفض الماصة في الغرفة وابحث عن الطرف الموجود أسفل الهدف. يجب أن تكون مقاومة الماصة بين 3-8 MΩ. استخدم ضغطا إيجابيا خفيفا باستخدام حقنة لرؤية مخروط المحلول يتدفق خارج الماصة وقم بخفض الماصة تدريجيا والهدف إلى سطح الشريحة.
- قم بتصحيح الخلية في تكوين مشبك الجهد: اقترب من الخلايا العصبية المحددة واضغط برفق على طرف الماصة على سوما. يجب أن ينتج الضغط الإيجابي غمازة على سطح الغشاء. حرر الضغط لإنشاء ختم جيجا أوم (مقاومة >1 GΩ). بمجرد إغلاقها ، اضبط جهد التثبيت على -65 مللي فولت. اكسر الغشاء بنبضة حادة من الضغط السلبي: يتم تحقيق ذلك عن طريق تطبيق شفط قوي على أنبوب متصل بحامل الماصة.
- سجل في وضع المشبك الحالي للخلية الكاملة استجابات الخلايا العصبية لخطوات التيار المفرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب (الشكل 1 أ).
ملاحظه: سيتم استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخصائص الجوهرية النشطة والسلبية للخلية. تستخدم إجراءات MATLAB المكتوبة حسب الطلب للتحليل خارج الإنترنت.
- سجل في استجابات ما بعد المشبكي الحالية أو الجهد المشبك لتحفيز LED كامل المجال 475 نانومتر للألياف الواردة التي تعبر عن كرونوس. التحفيز بقطارات من 10 محفزات مدتها 2 مللي ثانية عند 20 هرتز (الشكل 1 ب ، ج). قد تختلف شدة الضوء من 0.1 إلى 2 ميغاواط < br / >
ملاحظه: تم قياس شدة الضوء باستخدام وحدة تحكم طاقة بصرية رقمية محمولة باليد مزودة بمستشعر الثنائي الضوئي ، الموضوعة أسفل الهدف. زمن انتقال الاستجابة من 2 إلى 4 مللي ثانية هو سمة مميزة للاتصال أحادي المشبكي.
