المراقبة البصرية والفيزيولوجية الكهربية المتزامنة للخلايا العصبية في شرائح الدماغ

الملخص

المصدر: Murphy، C.A.، et al. التنشيط البصري الوراثي للمسارات الواردة في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات عن طريق التخدير المتطاير. J. Vis. إكسب. (2020)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير وتسجيل النشاط الكهربائي في وقت واحد من شرائح الدماغ المعدلة وراثيا التي تحتوي على بروتينات فلورية خاصة بالخلايا العصبية. يتضمن الإجراء الحفاظ على شريحة الدماغ في غرفة التروية باستخدام السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي الهوائي ، واستخدام مصدر ضوء لإثارة الخلايا المسماة بالفلورسنت ، وتسجيل الإشارات الكهربائية باستخدام مسبار متعدد القنوات ومشبك رقعة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. إعداد الأجهزة والبرامج للتسجيلات متعددة القنوات

1. قم بإعداد نظام الحصول على البيانات من 16 قناة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: يمكن استخدام العديد من مكبرات الصوت وأنظمة الحصول على البيانات المتاحة تجاريا لجمع التسجيلات متعددة القنوات. في التجارب الموضحة هنا ، يتم توصيل الإشارات التناظرية عبر لوحة مرجعية للقطب الكهربائي إلى مكبرات صوت ، حيث يتم تضخيمها (2000x) وتصفيتها (0.1-10 كيلو هرتز). يتم رقمنة المدخلات التناظرية لنظام الحصول على البيانات عند 40 كيلو هرتز.
2. اربط محول مرحلة الرأس المناسب المكون من 16 قناة بمعالج مجهر. قم بتوجيه المحول بحيث تكون منافذ الموصل الأنثوية متجهة لأسفل.
3. اضبط زاوية تشغيل هذا المعالج الدقيق بحيث يتم توجيهه لأسفل نحو غرفة التسجيل بزاوية 70 درجة تقريبا بالنسبة إلى الأفقي.
4. قم بتوصيل مدخل مرحلة الرأس بمسبار 16 × 1 للفيزيولوجيا الكهربية في المختبر عبر محول مرحلة الرأس المثبت على المعالج الدقيق.
5. قم بتوصيل موصل إخراج مرحلة الرأس بنظام الحصول على البيانات.
6. قم بتثبيت البرنامج المناسب للحصول على البيانات. قم بتكوين 15 قناة إدخال لتتوافق مع إشارات الإدخال من أول 15 جهة اتصال مسبار متعددة القنوات. قم بتكوين القناة المتبقية لتلقي المدخلات من القطب داخل الخلايا.
   ملاحظه: عند جمع البيانات وتحليلها ، احرص على مراعاة خرائط القطب الكهربائي والمحول للتأكد من أن الإشارة المناسبة تتوافق مع ملامسة القطب الكهربائي التي تم جمعها منها.

2. تكوين بروتوكولات تحفيز الضوء

1. قم بإعداد نظام توصيل خفيف وقم بتثبيت البرنامج المصاحب.
2. افتح البرنامج. اختر تكوين أسلاك الأجهزة حيث يوفر مصدر الزناد (رقمي / TTL (منطق الترانزستور - الترانزستور) مخرجا) إشارة Trigger In إلى نظام توصيل الضوء ، ويوفر نظام توصيل الضوء إشارة Trigger Out إلى 470 نانومتر LED (الصمام الثنائي الباعث للضوء).
3. قم بتركيب عدسة موضوعية عالية الطاقة. باستخدام كاميرا رقمية، قم بمعايرة الأهداف عالية الطاقة باستخدام نظام توصيل الضوء.
4. قم بإنشاء تسلسل ملف تعريف جديد لملفات تعريف تحفيز الضوء.
   1. قم بإنشاء نمط من الاختيار. في التجارب الموضحة هنا ، تسمح دائرة قطرها 150 ميكرومتر بالتنشيط الخاص بالطبقة لأطراف المحاور العصبية.
   2. لإنشاء تسلسل ملف تعريف، انسخ هذا الملف الشخصي ولصقه لكل عدد من الإصدارات التجريبية.
   3. قم بإنشاء قائمة أشكال موجية تحتوي على أشكال موجية من أي شدة ضوء أو مدة نبضة أو رقم نبضة.
   قم
   4. بتعيين أشكال الموجة بشكل عشوائي لكل ملف تعريف. يتوافق كل ملف تعريف مع شكل الموجة المخصص له مع نبضة تشغيل واحدة من إدخال TTL رقمي أو تجربة واحدة.
   5. احفظ تسلسل ملف التعريف.
5. في برنامج الحصول على البيانات ، قم بإنشاء بروتوكول جديد.
   1. قم بتعيين عدد الإصدارات التجريبية لتساوي عدد ملفات التعريف في تسلسل ملف التعريف الذي تم إنشاؤه.
   2. أختر مدخلات الإشارة لمطابقة تلك التي تم تكوينها في الخطوة 1.6. قم بتكوين بروتوكول يوفر إخراج TTL رقمي واحد، والتسجيل من قنوات الإدخال ال 16 هذه لفترة زمنية مناسبة قبل وبعد المشغل الرقمي.

فئة

3. وضع مسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي

1. الفقاقات eACSF (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي التجريبي) (ليس في أكياس محكمة الغلق) عند 3-6 مل / دقيقة.
2. انقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة اهتمام إلى الشبكة الشبكية في غرفة التروية المجهرية. مرساة مع القيثارة البلاتينية
3. قم بتدوير شبكة الشبكة بحيث يكون خط ملامسات القطب الكهربائي على الطرف البعيد للمسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح القرباغ.
4. قم بخفض المسبار متعدد القنوات باتجاه سطح الشريحة تحت إضاءة واسعة النطاق وتحكم دقيق في المعالج الدقيق.
5. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في المحطات المحورية للوافدين القشريين. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح اللوحة.
6. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة ، ~ 200 ميكرومتر أقل من موضع الهدف النهائي على طول المحور x ، مع ترك قناة واحدة على الأقل خارج حدود منطقة الأنسجة المسجلة.
7. أدخل المسبار ببطء في الشريحة عن طريق تحريك المعالج على طول محوره الطولي. لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم بتقدم المسبار فقط إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية أسفل سطح الأنسجة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الأضرار التي لحقت بالأنسجة مع ضمان ملامسة القطب الكهربائي للأنسجة.

< p class = "jove_title" >4. تصحيح لقط الخلايا العصبية المستهدفة والحصول على تكوين الخلية بأكملها

1. قم بتبديل مصدر eACSF إلى حل التحكم المعبأ.
2. تحديد الخلايا ذات العلامات الفلورية لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف.
   1. قم بتقييد غشاء قزحية الفتحة إلى أصغر قطر. قم بتشغيل عدسة موضوعية منخفضة الطاقة والتركيز على الأنسجة.
   2. قم بتوسيط الضوء على منطقة من الأنسجة المجاورة (ولكن غير متداخلة) المسبار متعدد القنوات.
   3. قم بإشراك هدف الغمر في الماء عالي الطاقة (40x أو 60x)، مع توخي الحذر لتجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية.
   4. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مجموعة المرشحات المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre.
   5. حدد خلية مصنفة بالفلورسنت كهدف لتسجيل مشبك التصحيح. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض الماصة الرقيعة.
3. قم بتحميل ماصة رقعة (انظر الجدول 1) بمحلول داخلي (الجدول 2) وقم بتركيب الماصة في حامل القطب. باستخدام حقنة 1 مل ، قم بتطبيق ضغط إيجابي يتوافق مع ~ 0.1 مل من الهواء.
4. اخفض ماصة التصحيح في المحلول. اجعل طرف الماصة في بؤرة التركيز تحت التوجيه البصري.
5. الحصول على تسجيل الخلية بأكملها من الخلية المستهدفة باستخدام الخطوات الموضحة سابقا33.
6. إذا كنت تخطط لتقييم التغييرات في الخصائص الجوهرية للخلية (على سبيل المثال ، مقاومة المدخلات ، ومعدل إطلاق الفعل المحتمل استجابة للخطوات الحالية) ، فقم بإجراء هذه التسجيلات. خلاف ذلك ، انتقل إلى بروتوكول تحفيز المحور العصبي أدناه.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: تكوين السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي والمحلول داخل الخلايا. يتم سرد الكواشف والتركيزات الخاصة ب eACSF ومحلول الماصة داخل الخلايا لتسجيلات مشبك التصحيح.

تجربة ACSF ، eACSF (بالملليمتر) كلوريد الصوديوم 111 NaHCO3 35 هيبس 20 كيه سي إل 1.8 ب CaCl2 2.1 MgSO4 1.4 كيه 2 ب 4 1.2 الجلوكوز 10 الحل الداخلي ك-غلوكونات 140 حيا كلوريد الصوديوم 10 هيبس 10 EGTA 0.1 إم جي اتب 4 NaGTP 0.3 الرقم الهيدروجيني = 7.2

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات عدسة موضوعية عريضة المجال 2.5x أوليمبوس MPLFLN2.5 ضعف عدسة موضوعية بالغمر في الماء 40x أوليمبوس LUMPLFLN40XW خليط 95٪ O2 / 5٪ CO2 إيرغاز Z02OX95R2003045 مسبار A16 الرابطة العصبية A16x1-2 مم -100-177-A16 مسبار 16 قناة جهاز مراقبة غاز التخدير (POET II) النقد 602-3 أ كلوريد الكالسيوم (CaCl2) دوت ساينتيك DSC20010 ACSF زجاج شعري (تسجيلات مشبك التصحيح) King Precision Glass، Inc. كجم -33 البورسليكات ، ID: 1.1 مم ، OD: 1.7 مم ، الطول: 90.0 مم الزجاج الشعري (الحقن الفيروسي) شركة دروموند العلمية 3-000-203-جم / إكس 3.5 بوصة التحكم في المناولة الدقيقة المبتدئة لويغ ونيومان س8 للتحكم في المعالج الدقيق الصغير التحكم في المتلاعبين وطاولة التبديل لويغ ونيومان SM7 للتحكم في القطب متعدد القنوات وطاولة التبديل ديجي داتا 1440 أ + كلامبكس 10 الأجهزة الجزيئية 1440 أ محول الأرقام والبرمجيات أنابيب E-3603 فيشر ساينتيك 14171208 لتوصيل خليط غاز 95٪ O2 / 5٪ CO2 إلى غرفة الحضانة + تطبيق الضغط أثناء لقط التصحيح EGTA دوت ساينتيك DSE57060 حل داخل الخلايا ERP-27 EEG مرجع / لوحة التصحيح نيورالينكس متقاعد ملء إبرة أدوات الدقة العالمية 50821912 لملء ماصات المشبك التصحيح مكعب مرشح لتصوير EYFP أوليمبوس U-MRFPHQ ورق الترشيح فيشر ساينتيك 09801ه وضع فوق قالب الشريحة أثناء تحضير كتلة الأنسجة مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني أداة سوتر ف -1000 2.5x2.5 خيوط صندوق أنبوب تشتت الغاز سيجما ألدريتش CLS3953312C حقنة زجاجية (100 مل) سيجما ألدريتش Z314390 لملء الأكياس المختومة بالغاز حمض الجلوكونيك ، ملح البوتاسيوم (K-gluconate) دوت ساينتيك DSG37020 حل داخل الخلايا الجلوكوز دوت ساينتيك DSG32040 ACSF GTP ، ملح الصوديوم سيجما ألدريتش G8877 حل داخل الخلايا محول مسبار الرأس الرابطة العصبية A16-OM16 محول لتوصيل مسبار 16 قناة بإدخال المسرح هيبس دوت ساينتيك DSH75030 ACSF ، محلول داخل الخلايا HS-16 Headstage نيورالينكس متقاعد إيزوفلوران باترسون البيطري 07-893-1389 كحول الأيزوبروبيل (70٪) VWR الدولية هاتف: 101223-746 مناور دقيق صغير لويغ ونيومان 210-100 000 0090-R للتلاعب بقطب مشبك التصحيح وحدة التحكم في مصدر ضوء LED ميغتكس BLS-PL02_US التحكم في مصدر الضوء البصري الوراثي مكبر الصوت Lynx-8 نيورالينكس متقاعد مزود الطاقة Lynx-8 نيورالينكس متقاعد كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) دوت ساينتيك DSM24300 ACSF mCherry ، تكساس مكعب مرشح أحمر صفاء 49008 للتصوير tdTomato الفلوري المراسل ميلوكسيكام حامل الماصة الدقيقة فيشر ساينتيك NC9044962 مضخة الحقنة الدقيقة أدوات الدقة العالمية UMP3-4 MultiClamp 700A الأجهزة الجزيئية / أدوات Axon 700 أ مكبر النيتروجين (لطاولة الهواء) إيرغاز 200 ناي شبكة النايلون فيشر ساينتيك 501460083 ممتدة فوق حدوة حصان من الأسلاك البلاتينية المسطحة ، شريحة الراحة فوق هذا أثناء التسجيلات نايلون مقطوع من جوارب طويلة العلامة التجارية العامة قطعة صغيرة لإنشاء منصة شريحة في غرفة الحضانة ، ألياف مفردة لإنشاء قيثارة بلاتينية ماصه دوت ساينتيك 307 لنقل الأنسجة إلى الحفارة سلك بلاتيني VWR الدولية BT124000 2 سم ، مسطح ، لعمل القيثارة البلاتينية مضلع 400 ميغتكس DSI-E-0470-0617-000 نظام توصيل الضوء البصري الوراثي ، يأتي مع برنامج PolyScan2 كلوريد البوتاسيوم (KCl) دوت ساينتيك DSP41000 ACSF فوسفات البوتاسيوم (KH2PO4) دوت ساينتيك DSP41200 ACSF كيس غاز مختوم فيشر ساينتيك 109236 طاولة التحول للمجهر لويغ ونيومان 380FMU بيكربونات الصوديوم (HCO3-) دوت ساينتيك DSS22060 ACSF كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) دوت ساينتيك DSS23020 ACSF ، محلول داخل الخلايا حقنة (1 مل) مع طرف LuerLock فيشر ساينتيك 309628 لتطبيق الضغط أثناء لقط التصحيح حقنة (1 مل) مع طرف انزلاق دبليو دبليو غرينجر ، إنك. 19 جي 384 لملء ماصات المشبك التصحيح مرشحات الحقن VWR الدولية 66064-414 مجهر عمودي أوليمبوس BX51 مناشف ويبال فيشر ساينتيك 19-042-427