تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. الاستعدادات قبل الجراحة
- تحضير محلول القطب الكهربائي
- لعمل محلول ردم القطب الكهربائي ، قم بإعداد محلول من أسيتات البوتاسيوم 4 M مع 140 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم.
- تحضير القطب الكهربائي
- باستخدام الشفط الفراغي ، أدخل ألياف الكربون T-650 (قطرها 7 ميكرومتر) في الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (الطول = 100 مم ، القطر = 1.0 مم ، القطر الداخلي = 0.5 مم).
- بمجرد وضع ألياف الكربون داخل الشعيرات الدموية الزجاجية ، ضع الشعيرات الدموية الزجاجية في مجتذب قطب كهربائي عمودي ، مع عنصر التسخين تقريبا في منتصف الشعيرات الدموية. اضبط السخان على 55 مع إيقاف تشغيل المغناطيس.
- بعد سحب الشعيرات الدموية ، ارفع حامل الشعيرات الدموية العلوي بعناية حتى لا يكون طرف القطب محاطا بعنصر التسخين.
- باستخدام مقص حاد ، قم بقص ألياف الكربون التي لا تزال تربط قطعتين من الشعيرات الدموية. سينتج عن ذلك قطبين صغيرين منفصلين من ألياف الكربون.
- تحت المجهر الضوئي ، قم بقص ألياف الكربون المكشوفة بعناية بمشرط حاد بحيث تمتد حوالي 75-100 ميكرومتر إلى ما وراء نهاية الزجاج.
- باستخدام المجهر الضوئي ، تأكد من خلو القطب الكهربائي من الشقوق على طول الشعيرات الدموية وأن الختم الذي تخرج منه ألياف الكربون من الشعيرات الدموية يصعب ملاحظته وخالي من الشقوق.
ملاحظه: سيساعد الختم الجيد في تقليل الضوضاء أثناء التسجيلات.
- تصنيع القطب المرجعي
- قم بلحام دبوس ذهبي بسلك فضي 5 سم.
- قم بتوصيل الأنود بمشبك ورق معدني أو موصل آخر ، والكاثود بدبوس ، وقم بتطبيق جهد (~ 2 فولت) أثناء غمر مشبك الورق والسلك الفضي في 0.1 متر حمض الهيدروكلوريك.
- أوقف الجهد بمجرد ظهور طلاء أبيض (AgCl) على السلك الفضي.
- تحضير الأقطاب الكهربائية للزرع
- قم بلحام دبوس ذهبي بسلك رفيع معزول (~ 10 سم في الطول ، < 0.50 مم قطر).
- قم بإزالة ~ 5 سم من العزل من السلك المقابل للدبوس الذهبي.
- املأ القطب الكهربائي في منتصف الطريق تقريبا بمحلول القطب.
- أدخل السلك المعزول في القطب.
ملاحظه: يجب أن يتلامس السلك مع ألياف الكربون داخل القطب.
< p class = "jove_title" >
2. زرع القطب الكهربائي
- أعط فئران Sprague Dawley البالغة والذكور (250-450 جم) حقنة داخل الصفاق (1.5 غ/كغ أو 1 مل/كغ حجم) بمقدار 0.5 جم/مل يوريثان مذاب في محلول ملحي معقم. ابدأ بجرعة أولية من اليوريثان تبلغ 1.0-1.2 غ/كجم. إذا كان لا يزال يستجيب لاختبار التحفيز الضار (قرص الذيل) بعد 20 دقيقة من إعطاء اليوريثان ، فقم بإعطاء 0.3-0.5 جم / كجم يوريثان إضافي لجرعة إجمالية تبلغ 1.5 جم / ك><غ.
ملاحظه: لتحضير محلول اليوريثان 0.5 جم / مل ، أضف 10 جم من اليوريثان إلى 10 جم (~ 10 مل) من المحلول الملحي. اليوريثان مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بحذر. ومع ذلك ، فهو مخدر مهم ، لأنه لا يغير مستويات الدوبامين ، كما تفعل التخدير الآخر مثل الكيتامين / الزيلازين وهيدرات الكلورال.
- بمجرد تخدير بعمق ولا يستجيب للمنبهات الضارة (على سبيل المثال ، قرصة إصبع القدم) ، ضعه في الإطار التجسيمي. ضع مادة تشحيم العين على كل عين من عيني الفئران.
ملاحظه: هذه جراحة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة ، ولكن يتم تشجيع تقنية التعقيم الجيدة.
- نظف فروة رأس الفئران باستخدام مقشر من مرحلتين (على سبيل المثال ، مقشر اليودوبوفيدون متبوعا بمقشر الإيثانول بنسبة 70٪ ؛ أداء مع تكرار 3 دورات).
- قم بقص أنسجة فروة الرأس باستخدام ملاقط أنف وإبرة معقمة ومقص جراحي. قم بإزالة كمية كبيرة من الأنسجة لإفساح المجال لعمليات الزرع المختلفة الموضحة أدناه.
- نظف سطح الجمجمة برفق باستخدام أدوات تطبيق ذات أطراف قطنية معقمة. ثم ضع 2-3 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ للمساعدة في التعرف على لامدا وبريجما.
- باستخدام مثقاب تجسيمي أو يدوي (1.0 مم ، ~ 20,000 دورة في الدقيقة) ، قم بحفر ثقب بقطر 1.5 مم 2.5 مم أمام البريجما و 3.5 مم جانبيا إلى البريجما. جزئيا (في منتصف الطريق تقريبا ، حتى يصبح ثابتا في مكانه) زرع برغي (1.59 مم OD ، بطول 3.2 مم) في هذه الفتحة. يوصى باستخدام محلول ملحي معقم للري أثناء الحفر لمنع الإصابة الحرارية.
- بالنسبة للقطب المرجعي ، قم بحفر ثقب قطره 1.0 مم 1.5 مم أمامي و 3.5 مم جانبيا للبريجما ، في نصف الكرة الأيسر.
- يدويا ، أدخل ~ 2 مم من السلك المرجعي في هذه الفتحة أثناء لف السلك المرجعي حول وتحت رأس المسمار المزروع.
- قم بزرع المسمار بالكامل ، وقم بتثبيت القطب المرجعي في مكانه.
- في نصف الكرة الأيمن ، قم بحفر ثقب قطره 1.5 مم 1.2 مم أمامي و 1.4 مم جانبيا للبريجما.
- قم بإزالة الجافية برفق باستخدام الملقط.
- بالنسبة للقطب الكهربائي المحفز ، قم بحفر ثقب مربع (2 مم أمامي خلفي ، 5 مم وسطي جانبي) متمركز عند 5.2 مم خلفي و 1.0 مم جانبيا إلى البريجما.
- باستخدام قضبان الذراع التجسيمية ، قم بخفض القطب المحفز ثنائي القطب / قنية التوجيه ثنائية القطب 5 مم أسفل الجافية. في حالة حدوث نزيف أثناء زرع القطب الكهربائي ، استخدم مسحات قطنية معقمة وشاشا لتقليل النزيف.
ملاحظه: تم تجهيز القطب المحفز ثنائي القطب المستخدم في هذه الطريقة بقنية توجيه (جدول المواد). يجب شطف القنية الداخلية المستخدمة مع هذا العنصر بالشوكات الموجودة على القطب المحفز ثنائي القطب عند إدخالها بالكامل في قنية التوجيه. سيسمح ذلك للقنية الداخلية بالجلوس مباشرة بين شوقي المحفز ، اللذين يفصلان حوالي 1 مم. تم وصف بروتوكول مماثل في مكان آخر.
- باستخدام قضبان الذراع التجسيمية ، قم بخفض القطب الصغير المصنوع من ألياف الكربون بمقدار 4 مم أسفل الجافية. يقع هذا الموقع في الجزء الظهري من المخطط.
- قم بتوصيل السلك المرجعي وألياف الكربون ببوتينسيوستات.
- قم بتطبيق شكل موجة مثلثي (-0.4−1.3 فولت ، 400 فولت / ثانية) لمدة 15 دقيقة عند 60 هرتز ، ومرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 10 هرتز
ملاحظه: عادة ، عند تطبيق الأشكال الموجية على الأقطاب الكهربائية الدقيقة من ألياف الكربون في الدماغ ، تضاف مجموعات الأكسيد إلى سطح ألياف الكربون. يجب الوصول إلى توازن هذا التفاعل قبل التسجيل. خلاف ذلك ، سيحدث انجراف كبير19. يسمح تدوير القطب الكهربائي بترددات أعلى (60 هرتز) لألياف الكربون بتحقيق التوازن بشكل أسرع.
فئة
3. تحسين ألياف الكربون وتحفيز مواقع القطب الكهربائي / قنية التوجيه
- اضبط المحفز لإنتاج شكل موجة كهربائية ثنائية القطب ، بتردد 60 هرتز ، و 24 نبضة ، وتيار 300 ميكرو أمبير ، وعرض نبضة يبلغ 2 مللي ثانية / مرحلة.
- اخفض المحفز برفق بزيادات قدرها 0.2 مم من 5 مم إلى 7.8 مم تحت الجافة. عند كل زيادة ، قم بتحفيز VTA.
ملاحظه: في الأعماق الظهرية (5-6 مم) ، عادة ما يتسبب تحفيز الدماغ (~ 80٪ من الوقت) في ارتعاش شعيرات الفئران. في أعماق أبعد ، ستتوقف الشعيرات عن الوخز ، والذي يحدث بين 7.5-8.2 مم تحت الجافية. عندما تتوقف الشعيرات عن الوخز ، سيكون القطب المحفز بالقرب من VTA أو فيه. لن يحدث هذا في كل فأر ، ولا ينبغي اعتبار نقص ارتعاش الشعيرات علامة على أن قنية القطب / التسريب المحفزة ثنائية القطب في غير محلها. قد لا يحدث ارتعاش الشعيرات لجميع التخدير (على سبيل المثال، الأيزوفلوران).
- استمر في خفض القطب المحفز ثنائي القطب / قنية التوجيه حتى ينتج عن التحفيز إطلاق DA الطوري في القطب الصغير المصنوع من ألياف الكربون (حاليا في المخطط الظهري).
ملاحظه: لن يحدث إطلاق DA في المخطط الظهري دائما إذا تم زرع القطب ثنائي القطب في VTA ، ولكن عادة ما تكون ملاحظة إطلاق DA في المخطط الظهري عند تحفيز VTA علامة جيدة على ملاحظة إشارة جيدة في قلب NAc.
- اخفض القطب الكهربائي الدقيق من ألياف الكربون حتى يصبح أقل من 6.0 مم على الأقل. هذا هو الجزء الظهري من قلب NAc.
- تحفيز VTA وتسجيل ذروة سعة ذروة DA.
- قم بخفض أو رفع القطب الكهربائي الدقيق من ألياف الكربون في الموقع الذي ينتج أكبر إصدار DA.
- تأكد من أن ذروة استجابة DA هي ذروة أكسدة واضحة عند 0.6 فولت وذروة اختزال عند -0.2 فولت. تشير هذه القمم إلى DA.
فئة
4. تسجيل التسريب والتحفيز FSCV
ملاحظة: يوضح الشكل 1 الجدول الزمني للتسجيل قبل وبعد التسريب الدقيق VTA.
- بمجرد تحسين موقع ألياف الكربون والقطب الكهربائي / قنية التوجيه المحفزة ، قم بالتحفيز لمدة ~ 20-30 دقيقة
ملاحظه: بموجب معايير التحفيز الحالية ، لا تحفز أكثر من مرة كل 3 دقائق ، للسماح بإعادة تحميل الحويصلات 22.
- بعد تحقيق خط أساس مستقر (<20٪ تباين على خمسة محفزات) ، قم بخفض القنية الداخلية برفق يدويا في قنية التوجيه المثبتة مسبقا في المحفز ثنائي القطب.
- خذ تسجيلات أساسية إضافية 2-3 للتأكد من أن إدخال القنية نفسه لم يغير الإشارة المستحثة. في بعض الحالات ، يمكن أن يؤدي إدخال وإزالة القنية الداخلية إلى إتلاف VTA. إذا تغيرت الإشارة بشكل جذري خلال فترة خط الأساس هذه (>20٪) ، فخذ تسجيلات إضافية 3-4 حتى يستقر خط الأساس.
- باستخدام مضخة حقنة وحقنة صغيرة ، قم بنقع 0.5 ميكرولتر من المحلول (على سبيل المثال ، 0.9٪ محلول ملحي ، N-methyl-D-aspartate [NMDA] ، (2R) -amino-5-phosphonovaleric acid [AP5]) في VTA على مدى دقيقتين.
- بعد التسريب ، اترك القنية الداخلية لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الإزالة.
ملاحظه: قد تتطلب بعض الأدوية ترك القنية الداخلية لفترة أطول بناء على حركية الدواء ، وقد تتسبب إزالة القنية الداخلية في انتقال الدواء مرة أخرى عبر القنية الداخلية. إذا كان هناك قلق ، فيمكن للمرء ترك القنية الداخلية في قنية الدليل أثناء التسجيل بأكمله. خلاف ذلك ، يمكن أن يبدأ التسجيل بعد هذه الفترة الزمنية البالغة 1 دقيقة.
- استمر في التسجيل كل 3 دقائق لقياس تأثيرات ما بعد التسريب.
ملاحظه: في حالة غرس محلول التحكم ، ولم يلاحظ أي تأثير ، فمن الممكن غرس مرة ثانية10. إذا كان هناك تغيير في إطلاق DA ناتج عن إدخال القنية الداخلية أو التسريب الملحي ، فعادة ما تستعيد الإشارة إلى خط الأساس في غضون 30 دقيقة.
