تحديد اختبار تأثير هرمون النمو على الخلايا العصبية كيسببتين باستخدام خلية كاملة التصحيح المشبك

الملخص

المصدر: Silva ، J. d. N. ، et al. ، الخلايا العصبية Kisspeptin تحت المهاد كهدف لتسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة. J. Vis. Exp. (2023)

يوضح هذا الفيديو استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها لقياس الاستجابات في الخلايا العصبية كيسببتين من شرائح ما تحت المهاد للفأر المنقولة. تتضمن العملية تحقيق تكوين الخلية الكاملة وتسجيل التغيرات المحتملة للغشاء التي يسببها هرمون الاختبار باستخدام وضع المشبك الحالي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. ختم الخلية للتسجيل

1. تأكد من تشغيل جميع قطع المعدات (المجهر ، مكبر الصوت ، محول الأرقام ، معالج الدقيق ، وغيرها) قبل بدء التسجيل.
2. املأ غرفة التسجيل ، من علامة تجارية (جدول المواد) ، وقم بتثبيته بالمجهر بمحلول aCSF للتسجيلات. استخدم مضخة التروية لنشر aCSF باستمرار بمعدل 2 مل / دقيقة.
3. انقل شريحة من الدماغ (واحدة تلو الأخرى) إلى غرفة التسجيل. استخدم ماصة نقل الأكريليك (ماصة زجاجية مقلوبة من باستير متصلة بحلمة سيليكون) لنقل شرائح منطقة ما تحت المهاد إلى الغرفة. استخدم مرساة شريحة (جدول المواد) لتثبيت الشريحة حتى لا تتحرك أثناء نضح aCSF.
4. ضع شريحة في وسط غرفة التسجيل متصلة بالمجهر. يعد موضع الشريحة أمرا بالغ الأهمية للسماح برؤية جيدة للمنطقة المطلوبة تحت المجهر وللوصول المثالي إلى الماصة الدقيقة المسجلة.
5. استخدم العدسة الموضوعية منخفضة الطاقة في المجهر الغاطس (10x أو 20x) للمساعدة في تحديد موضع الشريحة وتحديد موقع المنطقة المعنية.
6. بعد تحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام ، قم بتبديل العدسة الموضوعية إلى العدسة عالية الطاقة (63x) وركز على مستوى الأنسجة ، مع ملاحظة البروتين الفلوري الداخلي وأشكال الخلايا في المنطقة المستهدفة لتحديد موقع خلايا كيسببتين على سطح شريحة الدماغ.
7. عند تحديد موقع خلية مستهدفة محتملة ، قم بتمييزها على شاشة الكمبيوتر باستخدام مؤشر الماوس أو عن طريق رسم تنسيق ، مثل مربع ، فوق منطقة الاهتمام. تساعد علامة شاشة الكمبيوتر في توجيه موضع الماصة الدقيقة للتسجيل إلى الخلية.
8. بعد تحديد الموقع الدقيق للخلية المستهدفة ، ارفع الهدف وأدخل الماصة الدقيقة المسجلة المملوءة بالمحلول الداخلي. عند وضع الماصة الدقيقة في حامل القطب الكهربائي، تأكد من ملامسة المحلول الداخلي للقطب الفضي.
   ملاحظه: لتحضير الماصة الدقيقة ووضعها ووضعها على حامل القطب.
9. استخدم ضغطا إيجابيا قبل غمر الماصة الدقيقة في محلول aCSF، لمنع الحطام من دخول الماصة الدقيقة، باستخدام حقنة مملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة من خلال أنبوب بولي إيثيلين (أطول ≈130 سم)؛ استخدم ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من الهواء.
10. باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، قم بتوجيه الماصة الدقيقة أسفل مركز الهدف. حرك الأزرار الموجودة على المعالج الدقيق لتوجيه الماصة الدقيقة على محور XYZ نحو الخلية المعنية.
11. اضبط التركيز البؤري لرؤية طرف الماصة الدقيقة واجعل التركيز البؤري أقرب إلى الشريحة، ولكن ليس قريبا جدا. قلل سرعة المعالج الدقيق وقم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى مستوى التركيز البؤري. تأكد من أن طرف الماصة الدقيقة لا يخترق الشريحة فجأة، بل ينزل ببطء حتى يلامس سطح الخلية/المنطقة المستهدفة.
12. استخدم ضغطا إيجابيا خفيفا (≈100 ميكرولتر) باستخدام المحقنة المملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب.
13. ركز على الخلية المستهدفة وحرك المعالج الدقيق ببطء على محور XYZ لتقريب الماصة الدقيقة منها. عند لمس الماصة الدقيقة بالخلية، ستلاحظ غمازة ناتجة عن الضغط المطبق من خلال طرف الماصة الدقيقة (الشكل 2C).
14. بعد تشكيل الدمل ، نظرا لقرب الماصة الدقيقة من الخلية ، قم بتطبيق شفط ضعيف وقصير عن طريق الفم (1-2 ثانية) من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة الدقيقة لتوليد الختم بين الماصة الدقيقة للخلية (ختم جيجاأوم أو جيجاسيل >1 GΩ ؛ الشكل 2 د). لتشكيل الختم ، استخدم وضع مشبك الجهد على البرنامج.
15. إذا ظل الختم مستقرا (يجب أن يكون ختم الجيجا أوم مستقرا ميكانيكيا وبدون تداخل في الضوضاء ، يتم تحديده عن طريق الملاحظة لمدة 1 دقيقة تقريبا) ، اضبط جهد الإمساك على أقرب إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية ذات الاهتمام. بالنسبة للخلايا العصبية تحت المهاد كيسببتين ، يوصى باستخدام -50 مللي فولت.
16. قم بتطبيق شفط قصير عن طريق الفم (الضغط السلبي) مع إغلاق الماصة الدقيقة على الخلية لكسر غشاء البلازما (الشكل 2E). يتم تحقيق التكوين المناسب للخلية الكاملة عندما يتم إجراء الشفط بقوة كافية بحيث لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة ولا يجذب جزءا كبيرا من الغشاء أو حتى الخلية.
17. تحقق من دليل إعدادات النظام المستخدم. استخدم البرنامج (انظر جدول المواد) للتحقق رقميا من مقاومة السلسلة (SR) وسعة الخلية بأكملها (WCC) وحسابها.
18. في وضع مشبك الجهد ، بعد كسر غشاء الخلية ، قم بتمكين خيار الخلية بأكملها ، وانقر فوق الأمر التلقائي الذي يشير إلى علامة تبويب الخلية بأكملها. سيتم حساب SR و wcc للخلية تلقائيا وعرضها على الفور بواسطة البرنامج. يمكن أيضا التحقق من هذه المعلمات عن طريق إجراء اختبار الغشاء باستخدام مكبر الصوت المذكور في جدول المواد.
19. تأكد من التحقق من معلمات صلاحية الخلية. بالنسبة للخلايا العصبية كيسببتين ، تأكد من أن القياسات الفيزيولوجية الكهربية هي: < 25 مللي أوم ، ومقاومة المدخلات > 0.3 GΩ ، والاحتفاظ بالقيمة المطلقة الحالية < 30 باسكال متوسط قيمة WCC للخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin أو ARHkisspeptin هي ≈ 10-12 pF في الفئران السليمة الغدد التناسلية.
20. مراقبة SR وسعة الحالة المستقرة للخلية أثناء التجارب. تأكد من عدم تغيير SR بأكثر من 20٪ أثناء التسجيل وأن سعة الغشاء مستقرة.
21. تحقق من إعدادات البرنامج. قم بإنشاء بروتوكولات محددة للتسجيلات وفقا لنوع التجربة. لتسجيل إمكانات الغشاء في وضع المشبك الحالي ، مع المعدات المذكورة في جدول المواد ، قم بتصفية الإشارات الفيزيولوجية الكهربية عند 2-4 كيلو هرتز وتحليل النتائج في وضع عدم الاتصال في البرنامج (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البرنامج).
22. بمجرد تحقيق تكوين الخلية بأكملها بشكل صحيح ، قم بقياس التيارات المشبكية في وضع مشبك الجهد (الشكل 2G). سجل التغييرات في إمكانات غشاء الراحة (RMP) وتغيرات RMP المستحثة في وضع المشبك الحالي (الشكل 2H). يمكن إحداث التغييرات في RMP ، مثل إزالة استقطاب غشاء الخلية ، عن طريق إعطاء دواء / ناقل عصبي معروف في الحمام (الموضح في الخطوة 1.2) ، كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظه: في وضع المشبك الحالي ، يمكن حقن التيار الموجب أو السالب لتثبيت جهد الغشاء بالجهد المطلوب. بالنسبة للخلايا العصبية كيسببتين ، عادة ما نضع حقن تيار صفري (I = 0) لتسجيل التباين التلقائي لإمكانات الغشاء.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: رسم تخطيطي يلخص مساهمة تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة في معرفة نشاط الخلايا العصبية كيسببتين. توجد الخلايا العصبية Kisspeptin (كما هو موضح باللون الأخضر) في النوى المحيطة بالبطينين الأمامية البطينية والمنقارية (AVPV / PeN) والنواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد (ARH). ترسل خلايا AVPV / PeNKisspeptin و ARHkisspeptin اتصالات مباشرة إلى الخلايا العصبية المطلقة لهرمو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مركبات aCSF ، حلول التقطيع الداخلية والتقطيع ATP سيجما ألدريتش / مختلف أ 9187 كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش / مختلف [ك7902] د- (+) - جلوكوز سيجما ألدريتش / مختلف جي 7021 EGTA سيجما ألدريتش / مختلف O3777 هيبس سيجما ألدريتش / مختلف إتش 3375 كيه سي إل سيجما ألدريتش / مختلف ص 5405 ك-غلوكونات سيجما ألدريتش / مختلف جي 4500 كوه سيجما ألدريتش / مختلف ص 5958 كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش / مختلف M9272 كبريتات المغنيسيوم سيجما ألدريتش / مختلف 230391 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش / مختلف S5886 فوسفات أحادي الصوديوم سيجما ألدريتش / مختلف S5011 بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش / مختلف الطراز S5761 المعدات مكبر الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B نظام الحصول على البيانات منخفض الضوضاء DIGIDATA 1440 الأجهزة الجزيئية دي دي 1440 المضخة التمعجية الرقمية إسماتيك ISM833C قفص فاراداي TMC 81-333-03 كاميرا التصوير لايكا DFC 365 FX معالج دقيق أدوات سوتر رو -200 مجتذب الماصات الدقيقة ناريشيجي PC-10 مجهر لايكا DM6000 FS غرفة الانتعاش أجهزة وارنر إنسترومنتس / هارفارد - غرفة التسجيل وارنر إنسترومنتس 640277 ملعقه فيشر علمي / مختلف السمك -14-375-10 ؛ سمكة -21-401-20 البرمجيات والأنظمة برنامج AxoScope 10 الأجهزة الجزيئية - برنامج القائد نظام المجال الواسع LAS X لايكا - الحصول على الصور وتحليلها MultiClamp 700B الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B برنامج القائد برنامج PCLAMP 10 لنظام التشغيل WINDOWS الأجهزة الجزيئية بكلاماب 10 قياسي ادوات قطب Ag / AgCl ، بيليه ، 1.0 مم وارنر إنسترومنتس 64-1309 مرساة الشريحة وارنر إنسترومنتس 64-0246