التقييم القائم على مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة للشبكات العصبية في شرائح الحبل الشوكي للفأر

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. الفيزيولوجيا الكهربية في المختبر

1. تحضير حلول لإعداد شريحة الحبل الشوكي وتسجيلها
   1. السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي
      ملاحظه: يستخدم السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) في غرفة حضانة الواجهة ، حيث يتم تخزين الشرائح حتى يبدأ التسجيل وأثناء التجارب كمادة للتعقيم والمخفف للأدوية. انظر الجدول 1 للاطلاع على التكوين التفصيلي.
2. تحضير aCSF يحتوي (بالملليمتر) على 118 كلوريد الصوديوم ، 25 NaHCO₃ ، 10 جلوكوز ، 2.5 كيلو كلولون ، 1 هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 1 MgCl₂ ، و 2.5 CaCl₂ عن طريق إضافة الكميات المطلوبة مما سبق ، باستثناء CaCl₂ ، إلى 2 لتر من الماء المقطر.
3. قم بغلي المحلول أعلاه بالكربوجين (95٪ O₂ ، 5٪ CO₂) لمدة 5 دقائق وأضف CaCl₂.
   ملاحظه: تمنع هذه الخطوة هطول الأمطار CaCl₂ ، أي يجب ألا يتحول المحلول إلى غائم. لتطبيق الدواء أثناء التجارب ، قم بتخفيف محاليل مخزون الأدوية في aCSF إلى التركيزات النهائية المرغوبة.

< p class = "jove_title" >2. السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي البديل بالسكروز

ملاحظة: يتم استخدام aCSF البديل بالسكروز أثناء التشريح وتقطيع الحبل الشوكي. كما هو موضح في الاسم ، يتم استبدال السكروز بكلوريد الصوديوم لتقليل الإثارة العصبية أثناء هذه الإجراءات مع الحفاظ على الأسمولية. انظر الجدول 1 للاطلاع على التكوين التفصيلي.

1. تحضير aCSF بديل بالسكروز يحتوي على (بالملليمتر) 250 سكروز ، و 25 NaHCO₃ ، و 10 جلوكوز ، و 2.5 KCl ، و 1 NaH₂PO₄ ، و 1 MgCl₂ ، و 2.5 CaCl₂ عن طريق إضافة الكميات المطلوبة من كل ما سبق ، باستثناء CaCl₂ ، إلى 300 مل من الماء المقطر.
2. ضعي المحلول بالكربوجين لمدة 5 دقائق ثم أضيفي CaCl₂.
3. قم بتخزين المحلول في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة تقريبا أو حتى يتكون المحلول من ملاط. تجنب تجميد المواد الصلبة واستخدمها في تناسق الطين.

فئة

3. إعداد مصفوفة الأقطاب الكهربائية

الدقيقة

ملاحظة: يتطلب سطح التلامس في MEA معالجة مسبقة لجعله محبا للماء.

1. قبل التجربة ، املأ MEA جيدا إما بمصل بقري الجنين (FBS) أو مصل الحصان (HS) لمدة 30 دقيقة.
2. قم بإزالة FBS أو HS واشطف MEA جيدا بحوالي خمس غسلات من الماء المقطر حتى يصبح الماء المقطر رغويا. املأ البئر ب aCSF ، جاهزا للاستخدام.

فئة

4. تحضير شريحة الحبل الشوكي الحادة

1. قم بتخدير الفأر بعمق باستخدام 100 مجم / كجم من الكيتامين (IP) ثم قم بقطع رأسه باستخدام مقص جراحي كبير.
2. قم بإزالة الجلد فوق منطقة البطن عن طريق عمل قطع صغير في الجلد على مستوى الوركين. اسحب الجلد على جانبي الجرح بشكل منحرف حتى تتم إزالة الجلد بالكامل ، أي من أعلى القفص الصدري إلى أعلى الحوض (بطنيا وظهريا).
3. ضع الجسم على الجليد واستخدم نهجا بطنيا لفضح العمود الفقري عن طريق إزالة جميع الأحشاء وقطع الأضلاع الجانبية إلى القص.
4. قم بإزالة القفص الصدري البطني ، كل من لوح الكتف (مقطوع عند T2 تقريبا) ، والأطراف السفلية والحوض (مقطوعة في الجزء العلوي من العجز تقريبا).
5. انقل العمود الفقري ومستحضر الضلع إلى حمام تشريح يحتوي على السكروز المثلج aCSF. قم بتثبيت جميع الزوايا الأربع للمستحضر (السطح البطني لأعلى) عن طريق وضع المسامير من خلال عضلات أسفل الظهر والأضلاع العلوية المرفقة.
6. قم بإزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة التي تغطي السطح البطني للفقرات مع rongeurs وتحديد المنطقة الفقرية فوق التضخم القطني العجزي ، والذي يقع تقريبا تحت الأجسام الفقرية T12 إلى L2.
7. قم بإزالة الجسم الفقري الذيلية لمنطقة التضخم القطني العجزي لتوفير الوصول إلى الحبل الشوكي أثناء وجوده في القناة الفقرية.
8. باستخدام مقص زنبركي منحني ، قم بقطع العنق الفقرية بشكل ثنائي أثناء رفع وسحب الجسم الفقري بشكل دائري لفصل الجوانب البطنية والظهرية للفقرات وفضح الحبل الشوكي.
9. بمجرد إزالة الأجسام الفقرية للكشف عن التضخم القطني العجزي ، قم بتنظيف الجذور المتبقية التي تثبت الحبل الشوكي بمقص زنبركي بعناية حتى يطفو الحبل الحر بحرية.
10. اعزل الحبل الشوكي بقطع منقارية وذيلية أعلى وأسفل التضخم القطني العجزي ، مما يسمح للمنطقة المستهدفة من الحبل بأن "تطفو بحرية><". ملاحظه: سيحدد اتجاه الشريحة المفضل كيفية تركيب السلك لاحقا للتقسيم (الشكل 1).
11. بالنسبة للشرائح المستعرضة ، ارفع الجزء القطني العجزي من جذر متصل وضعه على كتلة البوليسترين (الستايروفوم) المقطوعة مسبقا (1 سم × 1 سم × 1 سم) مع قناة ضحلة مقطوعة في المنتصف. استخدم لاصق سيانواكريليت (انظر جدول المواد) لربط الكتلة والسلك بمنصة التقسيم ووضعها في حمام القطع الذي يحتوي على السكروز المثلج aCSF (الملاط).
    ملاحظه: تساعد القناة الضحلة على تأمين الحبل الشوكي وتوجيهه ، مع تعرض الجانب الظهري والنهاية الصدرية للحبل في الجزء السفلي من الكتلة.
12. بالنسبة للشرائح السهمية ، ضع خطا رفيعا من مادة لاصقة cyanoacrylate على منصة التقسيم ، وارفع التضخم القطني العجزي بواسطة جذر متصل ، ثم ضع الحبل على طول خط الغراء ، مع التأكد من وجود سطح جانبي واحد في المادة اللاصقة والوجوه الأخرى لأعلى. ضعه في حمام التقطيع الذي يحتوي على السكروز المثلج aCSF (الملاط).
13. بالنسبة للشرائح الأفقية ، ضع خطا رفيعا من مادة لاصقة cyanoacrylate على منصة التقسيم. ارفع التضخم القطني العجزي بواسطة جذر متصل ، وضع التضخم القطني العجزي على طول خط المادة اللاصقة ، مع التأكد من أن السطح البطني في المادة اللاصقة وأن السطح الظهري متجها لأعلى. استخدم الجذور المرفقة لوضع الحبل. ضعه في حمام التقطيع الذي يحتوي على السكروز المثلج aCSF (الملاط).

5. تسجيلات مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة

ملاحظة: توضح الخطوات التالية بالتفصيل كيفية استخدام بيانات السجل من التجارب المستندة إلى MEA على شرائح الحبل الشوكي. يمكن استخدام العديد من تصميمات MEA اعتمادا على التجربة. يتم عرض تفاصيل تصميم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في هذه التجارب في الجدول 2 والشكل 2. تم نشر معلومات التصميم التفصيلية بواسطة Egert et al. و Thiebaud et al. للمتوسطات المتوسطة المستوية وثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) ، على التوالي. يتكون كلا النوعين من MEA من 60 قطبا كهربائيا من نيتريد التيتانيوم ، مع طبقة عازلة من نيتريد السيليكون ومسارات نيتريد التيتانيوم ومنصات التلامس.

1. الإعداد التجريبي
   1. قم بتشغيل الكمبيوتر ولوحة الواجهة ، وابدأ تشغيل برنامج التسجيل.
   2. قم بتحميل قالب التسجيل المجمع مسبقا (الشكل 3 أ). قم بتسمية ملفات اليوم في علامة تبويب المسجل.
   3. قم بفقاعة aCSF باستمرار مع الكربوجين (5٪ CO₂ ، 95٪ O₂) طوال مدة التجربة.
   4. قم بتشغيل نظام التروية ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة مضخة تمعجية. ضع خط المدخل في aCSF ونهاية المدخل في دورق نفايات. قم بتجهيز خطوط التروية باستخدام aCSF.
   5. تحضير 4-AP وأي محاليل دوائية أخرى عن طريق تخفيف المخزونات في 50 مل من aCSF إلى التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، 200 ميكرومتر ل 4-AP).
2. 4-نشاط أمينوبيريدين (4-AP)
   1. بعد الحضانة، انقل شريحة واحدة من الحاضنة باستخدام ماصة باستور ذات طرف كبير مملوءة ب aCSF.
   2. ضع الشريحة في MEA جيدا وأضف aCSF إضافيا.
   3. ضع الشريحة فوق مجموعة التسجيل المكونة من 60 قطبا كهربائيا باستخدام فرشاة رسم دقيقة للشعر القصير. تجنب ملامسة الأقطاب الكهربائية بفرشاة الرسم أو سحب الأنسجة عبر الأقطاب الكهربائية ، خاصة إذا كنت تستخدم مصفوفات ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظه: اعتمادا على تخطيط الشرق الأوسط وأفريقيا ، يمكن القيام بذلك بمساعدة المجهر أو بدونه لتحديد المواقع بدقة.
   4. بعد وضع الشريحة ، ضع شبكة مرجحة فوق الأنسجة لتثبيتها في مكانها وتعزيز التلامس الجيد مع أقطاب MEA.
      ملاحظه: قد تحتاج الشريحة إلى إعادة وضع بعد التنسيب الصافي.
   5. ضع MEA في منصة التسجيل (الشكل 2 أ ، ب).
   6. تحقق من موضع الأنسجة فوق الأقطاب الكهربائية باستخدام مجهر مقلوب (تكبير 2x) للتأكد من أن أكبر عدد ممكن من الأقطاب الكهربائية موجودة تحت القرن الظهري السطحي (SDH). تأكد من أن ما لا يقل عن 2-6 أقطاب كهربائية لا تلامس الشريحة لأن هذه الأقطاب الكهربائية مهمة لطرح الضوضاء وتسجيل القطع الأثرية أثناء التحليل (الشكل 2 ه).
   7. قم بتشغيل الكاميرا ، وتوصيلها بالجهاز ، والتقط صورة مرجعية للشريحة بالنسبة إلى MEA لاستخدامها أثناء التحليل.
   8. اضغط على Start DAQ (الحصول على البيانات) في برنامج التسجيل وتأكد من أن جميع الأقطاب الكهربائية تتلقى إشارة واضحة.
      ملاحظه: إذا كانت الإشارة صاخبة ، فقم بفك مشبك الرأس ، وقم بتنظيف كل من وسادات التلامس MEA وملامسات الزنبرك الذهبية بنسبة 70٪ من الإيثانول (استخدم مناديل مختبرية للتأكد من جفاف الوسادات ونقاط التلامس بعد التنظيف). إذا كانت الإشارة لا تزال صاخبة، فقم بإيقاف تشغيل الأقطاب الكهربائية المعطلة في برنامج التسجيل أو قم بتدوين الاستبعاد لاحقا أثناء التحليل.
   9. قم بتوصيل خطوط مدخل ومخرج التروية ببئر MEA (المملوء سابقا ب aCSF) وقم بتشغيل نظام التروية. تحقق من معدل التدفق ، من الناحية المثالية 4-6 أحجام حمام في الدقيقة ، وتأكد من أن التدفق الخارج كاف لمنع فيضان الصحف الفائق.
   10. اسمح للأنسجة بالتوازن لمدة 5 دقائق ثم سجل 5 دقائق من بيانات خط الأساس الأولية غير المصفاة.
   11. انقل خط مدخل التروية من aCSF إلى محلول 4-AP وانتظر لمدة 12 دقيقة حتى يصل النشاط الإيقاعي الناجم عن 4-AP إلى حالة مستقرة (دقيقتان حتى تصل الأدوية إلى الحمام و 10 دقائق حتى يصل النشاط إلى ذروته ثم هضبة).
   12. سجل 5 دقائق من النشاط الناجم عن 4-AP. كن مستعدا للتسجيلات اللاحقة لاختبار الأدوية أو للتحقق من استقرار 4-AP.

< ص الفئة = "jove_content" >الجدول 1: تركيبات السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي.

كيميائي aCSF (ملي متر) aCSF (جم / 100 مل) aCSF البديل بالسكروز (mM) aCSF المستبدل بالسكروز (جم / 100 مل) aCSF عالي البوتاسيوم (mM) aCSF عالي البوتاسيوم (جم / 100 مل) كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 118 0.690 - - 118 0.690 كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO₃) 25 0.210 25 0.210 25 0.210 الجلوكوز 10 0.180 ر.ث 10 0.180 ر.ث 10 0.180 ر.ث كلوريد البوتاسيوم (KCl) 2.5 0.019 2.5 0.019 4.5 0.034 فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH₂PO₄) 1 0.012 1 0.012 1 0.012 كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) 1 0.01 1 0.01 1 0.01 كلوريد الكالسيوم (كلوريد_{الكالسيوم 2}) 2.5 0.028 2.5 0.028 2.5 0.028 سكروز - - 250 حيا 8.558 - -

الجدول 2: تخطيطات مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة.

مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة "5" > نموذج صفيف القطب الكهربائي الدقيق 60 مليون دولار أمريكي 200 / 30 آي آر تي 60-3DMEA 100/12 / 40iR-Ti 60-3DMEA 200/12 / 50iR-Ti 60 مليون دولار أمريكي 500 / 30 آي آر تي آي مستو أو ثلاثي الأبعاد (3D) مستو 3D 3D مستو شبكة القطب الكهربائي 8 س 8 8 س 8 8 س 8 6 س 10 تباعد القطب الكهربائي 200 ميكرومتر 100 ميكرومتر 200 ميكرومتر 500 ميكرومتر قطر القطب الكهربائي 30 ميكرومتر 12 ميكرومتر 12 ميكرومتر 30 ميكرومتر ارتفاع القطب الكهربائي (3D) غير متاح 40 ميكرومتر 50 ميكرومتر غير متاح التجارب شريحة عرضية شريحة عرضية السهمي + الأفقي السهمي + الأفقي

الشكل 1: اتجاهات شريحة الحبل الشوكي وطرق التركيب والقطع. (أ) تتطلب الشرائح المستعرضة كتلة قطع الستايروفوم مع أخدود داعم مقطوع فيها. يستقر الحبل الشوكي على الكتلة الموجودة في أخدود الدعم ، ويواجه الجانب الظهري من الحبل بعيدا عن الكتلة. يتم لصق الكتلة والسلك على مرحلة القطع باستخدام مادة لاصقة سيانواكريلات. (ب) يتم تحضير شرائح السهمية عن طريق وضع خط رفيع من مادة لاصقة cyanoacrylate على مرحلة القطع ثم وضع الحبل الشوكي على جانبه على الغراء. (ج) يتم تحضير الشرائح الأفقية عن طريق وضع خط رفيع من مادة لاصقة cyanoacrylate على مرحلة القطع ثم وضع الجانب البطني للحبل الشوكي لأسفل على الغراء.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: وضع الأنسجة على مجموعة الأقطاب الكهربائية الدقيقة. (أ) تظهر الصورة منصة رأس مفتوحة لمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا مع وضع MEA في موضعه. (ب) مثل A مع إغلاق منصة MEA للتسجيلات ونظام نضح الأنسجة في مكانه. (ج) تظهر الصورة منطقة طيران وأفريقيا كما توفرها الشركة المصنعة. يتم عرض وسادات التلامس ، التي تتفاعل مع الينابيع الذهبية للرأس ، وحمام الأنسجة MEA الذي يحمل محلول استحمام الأنسجة وشريحة الأنسجة. المنطقة التي يبرزها المربع الأحمر في الوسط هي موقع مصفوفة الأقطاب الكهربائية. (د) تظهر المخططات تكويني قطب MEA المستعملين في هذه الدراسة ، مع مزيد من التفاصيل المعروضة في الجدول 2. يشار إلى القطب المرجعي بشبه المنحرف الأزرق. يظهر تخطيط قطب MEA الأيسر تكوينا مربعا مكونا من 60 قطبا كهربائيا ، يستخدم أكثر في نماذج العمل المعروضة 60MEA200 / 30iR-Ti بأقطاب قطرها 30 ميكرومتر متباعدة بمقدار 200 ميكرومتر ، أو 200 ميكرومتر متباعدة و 100 ميكرومتر متباعدة بين MEAs ثلاثية الأبعاد (60MEA200 / 12 / 50iR-Ti و 60MEA100 / 12 / 40iR-Ti) بأقطاب كهربائية قطرها 12 ميكرومتر وارتفاع 50 ميكرومتر أو 40 ميكرومتر ، على التوالي. يظهر تخطيط القطب الكهربائي الأيسر MEA تخطيطا مستطيلا بحجم 6 × 10 قطب كهربائي - 60MEA500 / 30iR-Ti. (ه) صورة عالية التكبير لمربع MEA 60MEA100 / 12 / 40iR-Ti مع شريحة عرضية من الحبل الشوكي موضوعة للتسجيل. تقع الشريحة على صفوف القطب الكهربائي 3-8. يعمل الصف العلوي من الأقطاب الكهربائية ، التي لا تلامس أي نسيج ، كأقطاب كهربائية مرجعية. تظهر منطقة SDH كشريط شبه شفاف. في هذه الحالة ، يتغطى SDH بأقطاب كهربائية في الصفوف 4 و 5 و 6 والأعمدة 2 و 3 و 4 و 5 و 7 من MEA. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: MEA = مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة. [سده]=سطحية [سرسل] قرن. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 3: تخطيطات أداة تسجيل البيانات وتحليلها وأمثلة على تسجيلات مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي تظهر إمكانات العمل خارج الخلية والأشكال الموجية المحتملة للمجال المحلي. (أ) يعرض التخطيطي نموذج تسجيل تم تشكيله مسبقا يستخدم للحصول على بيانات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. يتيح ربط MEA2100 وأداة التسجيل (headstage/amplifier) تسمية البيانات وحفظها. تم جمع أربعة أمثلة على آثار البيانات الأولية (اليمين ، فترات مدتها 5 دقائق) بواسطة قناة MEA واحدة تظهر النشاط عند خط الأساس ، بعد 12 دقيقة من تطبيق 4-AP ، و 15 دقيقة أخرى بعد نشاط 4-AP الثابت ، وبعد تطبيق حمام TTX (1 ميكرومتر). لاحظ أن إضافة 4-AP (التتبع الثاني) ينتج عنه زيادة واضحة في ضوضاء الخلفية ونشاط EAP/LFP. الأهم من ذلك ، أن النشاط يظل مستقرا نسبيا لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد إنشاء النشاط الناجم عن 4-AP (التتبع الثالث). إضافة TTX (1 ميكرومتر) تلغي جميع الأنشطة (التتبع السفلي). (ب) يعرض التخطيطي (يسار) تكوين برنامج المحلل لتحليل البيانات. تستخدم أداة مستكشف البيانات الأولية لاستيراد التسجيلات التي تم جمعها بواسطة برنامج التسجيل. ثم يتم تشغيل هذه البيانات من خلال أداة تصفية عبر القنوات تطرح إشارة (إشارات) القطب المرجعي المحدد من الأقطاب الكهربائية الأخرى لإزالة ضوضاء الخلفية. تمر البيانات عبر مرشح EAP وأدوات مرشح LFP لتحسين علاقات الإشارة إلى الضوضاء لكل شكل موجة. بعد هذه الخطوة، تدخل بيانات مسار EAP إلى أداة كاشف EAP، حيث يتم تعيين العتبات. يتم اكتشاف EAPs ثم إرسالها إلى أداة محلل EAP حيث يتم تسجيل زمن انتقال كل حدث وتصديره كtxt. ملف. يحدث سير عمل مماثل لبيانات LFP باستخدام مجموعة أدوات LFP المقابلة. تظهر الآثار اليمنى بيانات من قناة MEA واحدة تحتوي على أشكال موجية مختلفة خارج الخلية. يتم تمييز موقع إشارات EAP و LFP في "البيانات النقطية" أعلاه. الآثار السفلية هي حقب من التسجيل العلوي (يشار إليها بأشرطة حمراء) تظهر أشكال الموجة على نطاق زمني موسع ، بما في ذلك إشارات LFP المختلفة (لاحظ تنوع المظاهر) و EAPs الفردية خارج الخلية (الدوائر الحمراء). لاحظ أن شكل موجة LFP / EAP وقطبية تختلف بالنسبة لعدد الخلايا العصبية التي تنتج هذه الإشارات ، وقربها من قطب التسجيل ، وموقعها فيما يتعلق بالقطب (الأقطاب) القريبة. الاختصارات: MEA = مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة. EAP = جهد العمل خارج الخلية ؛ LFP = إمكانات ميدانية محلية؛ 4-AP = 4-أمينوبيريدين. TTX = السموم الرباعية.