$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. إنشاء أقطاب RSNA ثنائية القطب
- لإنشاء القطب الكهربائي ، قم بقطع قطعتين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ بطول كل منهما حوالي 18 مم. قطع قطعة واحدة من أنابيب البولي إيثيلين (PE-50) بطول 15 مم تقريبا. قم بتغذية كلتا القطعتين من الأسلاك في الأنبوب ، مع ترك السلك بارزا من كلا الطرفين.
- قم بإزالة العزل من نهايات الأسلاك ؛ قم بقص الأسلاك تاركا 2-3 مم من الأسلاك المكشوفة. في أحد طرفيه ، قم بتجعيد المسامير الذكورية فوق السلك المكشوف. قم بلحام المسامير بإحكام بالسلك ، وقم بتأمين المسامير داخل شريط الموصل ، وقم بتغطية الوصلة بالإيبوكسي.
ملاحظه: النهج البديل الذي يتجنب اللحام هو استخدام مشابك التمساح سريعة التوصيل / التحرير.
- على الطرف الآخر من القطب ، قم بإزالة العزل من نهايات الأسلاك ، مع ترك 2-3 مم من السلك المكشوف. ثني هذا الجزء من الأسلاك لإنشاء خطافات صغيرة على شكل حرف "V" في السلك غير المعزول.
ملاحظه: هذا هو جزء القطب الكهربائي الذي سيكون ملامسا للعصب الكلوي الودي. من المهم إغلاق هذه النهاية لمنع دخول السوائل إلى الأنبوب. يمكن استخدام السيليكون أو الايبوكسي بشكل فعال.
2. إدارة التخدير وإعداد المواقع الجراحية
- قم بإعطاء التخدير لذكر فأر Sprague Dawley (من العمر 9-11 أسبوعا ، ويزن 150-400 جم). تطبيق البنتوباربيتال الصوديوم 50 ملغ/كغ عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP). لتقييم مستوى التخدير المستقر أثناء الجراحة، افحص منعكس قرصة إصبع القدم كل 15 دقيقة وأعد جرعة التخدير حسب الحاجة.
ملاحظه: تم استخدام الصوديوم البنتوباربيتال (نيمبوتال) في الدراسات السابقة لتحقيق مستوى مخدر مستدام دون التدخل في تعديل RSNA. هذا البروتوكول مخصص لجراحة عدم البقاء على قيد الحياة ، لذلك لا توجد فترة تعافي / مراقبة ما بعد الجراحة.
- قم بإعداد موقع الجراحة وفقا لإرشادات رعاية المؤسسية (على سبيل المثال ، حلق بطن الفئران وظهرها ورأسها ؛ تنظيف الجلد بمحلول بوفيدون اليود بنسبة 10٪ ؛ وضع زيوت تشحيم العين ؛ ووضع الجرذ على وسادة تدفئة). حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية أثناء التجارب.
< p class = "jove_title" >
3. قنية الشريان الفخذي لمراقبة الضغط الشرياني المتوسط
- تصور الشريان تحت المجهر. على غرار الطريقة المستخدمة في القنية الوريدية ، اربط الخيط البعيد لسد الشريان ؛ قم بتثبيت حواف هذه الخيط في المجال الجراحي بشريط حريري وضع الشريان بشكل عمودي على يد الجراح المهيمنة.
- الوصول الشرياني في حالة استخدام القياس عن بعد
- افحص القسطرة المستشعرة للضغط تحت تكبير عال قبل قنية الشرايين. تأكد من خلو القسطرة من الفقاعات / الحطام وبها الغضروف المفصلي السليم بين المكونات المملوءة بالسوائل (القريبة) والمملوءة بالهلام (البعيدة). قبل كل عملية زرع ، أعد ملء الجل في الطرف البعيد للقسطرة. قم بتشغيل جهاز الإرسال باستخدام مغناطيس ؛ مراقبة ضغط الدم (BP) أثناء الجراحة لتحمل الوضع المثالي.
- استخدم نصف عقدة علوية فضفاضة في الخيط القريب لسد الشريان الفخذي لفترة وجيزة. أمسك مدخل القسطرة في اليد غير المهيمنة. أمسك طرف قنية وحدة القياس عن بعد باستخدام ملقط قنية الوعاء لتجنب إزاحة الجل من الحافة.
- ثقب ثقب في الشريان بإبرة 22G مثنية وأدخل القنية في الشريان باستخدام ملقط قنية الأوعية الدموية لتجنب إزاحة الجل من الحافة. تقدم القنية إلى أقصى حد ممكن. باستخدام أربطة الخياطة القريبة والبعيدة ، قم بتأمين قسطرة الضغط.
- دس جسم غرسة القياس عن بعد داخل الجناح المجاور للشق وأغلق هذا الشق باستخدام خياطة نايلون 4-0 على إبرة قطع. قم بإيقاف تشغيل أجهزة القياس عن بعد بواسطة المغناطيس في نهاية فترة التسجيل للحفاظ على عمر البطارية.
4. ضع الجرذ في إطار الجراحة التجسيمية للوصول إلى الدماغ
- حرك الجرذ برفق إلى وضع الانبطاح في إطار الجراحة التجسيمية.
- ضع الجرذ بين قضبان الأذن واضبط شريط القاطع لمعادلة ارتفاع لامدا وبريجما. قد يعتمد تحديد المواقع على سلالة الفئران والوزن ومواقع أهداف الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي).
- قم بعمل شق مشرط روستروكاوديال بطول 2 سم عبر خط الوسط لفروة الرأس. باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية ، قم بإزالة النسيج الضام بإحكام من سطح الجمجمة. ضع بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة للمساعدة في تصور خيوط بريجما ولامدا وخط الوسط.
- باستخدام أطلس لدماغ الفئران لتوجيه الاستهداف ، قم بحفر قطع عظم ثقب لدغ ، بحجم الوصول إلى القطب الكهربائي ، من خلال الجمجمة.
< p class = "jove_title" >
5. عزل الأعصاب الكلوية الودية
- قم بتوصيل قطب RSNA السلكي (الخطوات 1.1-1.3) بمكبر صوت مسبق 10X ومضخم قطب كهربائي صغير.
- اعزل الأعصاب الكلوية من خلال شق خلف الصفاق قبل أو بعد تأمين الجرذ في الإطار التجسيمي. ضع أقطاب RSNA بمجرد أن يكون الجرذ في الإطار التجسيمي. قم بعمل شق مشرط يمتد من 4-5 سم أسفل الأضلاع في الاتجاه الذيلي ، بشكل جانبي قليلا للعمود الفقري. يقوم بلانت بتشريح الشق لتصور العضلات المجاورة الشوكية.
- استخدم المقص لعمل شق عرضي سطحي للغاية بطول 1-2 سم حيث تلتقي الدهون بالعضلة. باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية ، انشر الدهون بعيدا عن العضلات لتصور الكلى. من المهم عدم دخول الفضاء البريتوني.
- استخدم المباعدات لفصل الكلى برفق عن العضلات المجاورة للنخاع لتصور الشريان الكلوي والشريان الأورطي البطني. لا تمد الأوعية بشكل مفرط لتجنب إتلاف الأعصاب الكلوية. استخدم وسادة شاش قطنية مقاس 2 × 2 بوصة مبللة بمحلول ملحي لحماية الكلى من الإصابة.
- تحت التكبير العالي، حدد الأعصاب الكلوية في جيب الشق. يمكن رؤية الحزم العصبية بسهولة أكبر في الزاوية اليمنى التي يشكلها الشريان الأورطي والشريان الكلوي. تتبع الأعصاب الكلوية عن كثب الشريان الكلوي من الشريان الأورطي إلى الكلى.
- حدد جزءا من حزمة العصب التي سيتم وضعها على قطب التسجيل. قم بتشريح الألياف العصبية برفق من الأنسجة / الأوعية الدموية المحيطة باستخدام ملاقط تشريح دقيقة.
- قم بتأمين قطب RSNA السلكي في حامل (على سبيل المثال ، مشبك تمساح متصل بحامل دعم). اخفض القطب إلى مستوى الجزء العصبي. استخدم خطافا عصبيا لرفع جزء العصب الكلوي برفق على القطب الكهربائي دون شد العصب.
ملاحظه: يجب أن يستقر العصب داخل كل من الخطافات على شكل حرف "V" في السلك غير المعزول ، بالتوازي مع العصب. يجب ألا تلمس أسلاك القطب أي أنسجة أو دم أو سائل ليمفاوي آخر.
- املأ الشق بالزيت المعدني لمنع الجفاف من الجفاف للعصب الكلوي الودي. استخدم مشبك تأريض مع أحد طرفيه على جلد الشق والآخر متصل بقفص فاراداي.
- قم بتوجيه الإشارة إلى مكبرات الصوت باستخدام ترشيح التمرير العالي والمنخفض (10 هرتز و 3 كيلو هرتز). اضبط الكسب حتى 10 كلفن. قم بتضمين شاشة صوتية لتقييم نمط الاندفاع ل RSNA. استخدم معدلات أخذ العينات التي تتراوح بين 2,000-10,000 هرتز. استخدم معدل أخذ العينات المتزايد عندما يفترض أن التلاعب بالجهاز العصبي المركزي يسبب استجابات متعاطفة سريعة / موجزة.
6. تسجيل البيانات
- تقييم جودة تسجيل RSNA عن طريق استحضار baroreflex بحقن 1 مل من المحلول الملحي أو 10 ميكروغرام / مل فينيليفرين (في 0.1 مل) عن طريق الوريد. كما هو موضح في الشكل 1 ، يجب أن يزيد التسريب من ضغط الدم ويمنع RSNA. زيادة في متوسط الضغط الشرياني من 60-80 مم زئبق كافية لتثبيط الودي الكلوي.
- اضبط موضع الأقطاب الكهربائية لتحسين الإشارة إذا لزم الأمر. يلزم إعادة التموضع إذا لم يكن العصب ملامسا لكلا الخطافين الموجودين على القطب الكهربائي أو إذا كان أي نسيج أو دم أو سائل ليمفاوي ملامسا للأسلاك.
ملاحظه: تعتمد الحاجة إلى إعادة التموضع على الخصائص السمعية لإفرازات الأعصاب.
- بمجرد الحصول على إشارة واضحة ، قم بتأمين قطب RSNA في مكانه عن طريق سحب الزيت المعدني ووضع هلام السيليكا لتغطية وصلة العصب / القطب الكهربائي في جيب الشق. لا تحرك الجرذ قبل أن يتماسك الجل تماما.
- قم بإجراء بروتوكولات معالجة الجهاز العصبي المركزي مع تسجيل RSNA باستمرار ومتوسط الضغط الشرياني. إذا تم استخدام حاقن دقيق / نابض لمعالجة جذع الدماغ ، فيمكن إدخال إشارة منطقية من هذا الجهاز في تسجيلات RSNA / BP لتوثيق توقيت التلاعب بالجهاز العصبي المركزي.
- عند اكتمال التجربة ، حدد مستوى الضوضاء عن طريق سحق العصب القريب من أقطاب التسجيل بين هلام السيليكا والعضلة الشوكية. سجل ما لا يقل عن 30 ثانية من هذه القيمة "الصفرية" ل RSNA. كنهج بديل لقياس الضوضاء ، قم بإدارة مانع عقدي قصير المفعول مثل الأتروبين أو السداسي ميثونيوم أو الكلوريزوندامين أو طرطرات البنتولينيوم.
- قم بإزالة قطب RSNA بعناية وإزالة أي آثار لهلام السيليكا من أقطاب السلك. احفظ القطب الكهربائي لإعادة الاستخدام. قم بإيقاف تشغيل جهاز القياس عن بعد وإزالته ، مع الحرص على عدم إتلاف طرف القسطرة.
