$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة
- انقل قسم الأنسجة الأول إلى غرفة التسجيل المغمورة في تدفق مستمر لمحلول كريبس. قم بتركيب القسم باستخدام أوزان خفيفة واغمر الهدف.
- تحديد المنطقة المخططة في المجهر والبحث عن الخلايا العصبية الإيجابية ل GFP (المعاد برمجتها). حدد خلية عصبية واسعة النطاق في التشكل ولا تغطيها حزم الألياف أو الأوعية الدموية.
- قم بإعداد ماصات زجاجية من البورسليكات (3-7 ميجاأوم) للترقيع وتعبئتها بالمحلول داخل الخلايا التالي (بالملليمتر): 122.5 غلوكونات البوتاسيوم، 12.5 كيلولولار، 0.2 EGTA، 10 هيبسوليكات هيبسولتر، 2 ملجمليزمات ATP، 0.3 Na3GTP و8 كلوريد الصوديوم، معدلة إلى الرقم الهيدروجيني 7.3 مع KOH.
- قم بتوصيل الماصة الزجاجية بقطب التسجيل واغمسها في المحلول. تحقق جيدا من مقاومة القطب. بعد ذلك ، اقترب ببطء من الخلية باستخدام الماصة ، مع الحفاظ على ضغط إيجابي طفيف على القطب لتجنب سد الحافة.
أنذر: احرص على تتبع خليتك أثناء نزول القطب الكهربائي وعدم تبييض التألق في الخلية (أي قم بإيقاف تشغيل المصباح الفلوري عندما لا تحتاج إليه).
- اشطف الأنسجة المحيطة بعناية باستخدام الضغط الإيجابي للقطب الكهربائي واقترب من الخلية بالقطب. حدد موقع القطب الكهربائي أعلى الخلية مباشرة وانزل حتى يلامس القطب الغشاء. قم بعمل ختم Giga-Ω بين القطب الكهربائي وغشاء الخلية ، ومع نبضات الضغط السلبي ، قم بتمزيق الغشاء لإنشاء رقعة خلية كاملة.
أنذر: الخلايا العصبية المعاد برمجتها حساسة. كن حذرا عند الترقيع ولا تضع الكثير من الضغط السلبي عند الوصول إلى ختم Giga-Ω أو فتح غشاء الخلية. أيضا ، يتطلب الترقيع على الأكبر سنا الممارسة والصبر لأن النسيج الضام أكثر سمكا ، ويصعب تصور الخلايا العصبية.
- تحقق من إمكانات غشاء الراحة فور اقتحامها في وضع المشبك الحالي وقم بتدوينها لتحليلها.
- في المشبك الحالي ، حافظ على الخلية بين -60 مللي فولت إلى -80 مللي فولت وحقن تيارات 500 مللي ثانية من -20 باسكال إلى +90 باسكال ، مع زيادات قدرها 10 pA للحث على إمكانات العمل.