تركيب النوافذ البصرية في دماغ الفئران المعدلة وراثيا لتصوير الأنشطة العصبية

الملخص

المصدر: Lin، X.، et al. تصوير النشاط العصبي في القشرة الحسية الجسدية الأولية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا Thy1-GCaMP6s.

يوضح هذا الفيديو تسجيل النشاط العصبي للدماغ من خلال نافذة بصرية في الفئران المعدلة وراثيا. تعبر الفئران عن بروتين فلوري يتيح اكتشاف الأنشطة العصبية. تتم إزالة جزء صغير من الجمجمة بعناية لتثبيت نافذة بصرية ، ثم يتم تغطية الجمجمة بالأسمنت الأسود لحجب الضوء قبل التصوير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير للتصوير

1. ضع شاشا معقما ومسحات قطنية وأدوات جراحية معقمة في منطقة الجراحة. قم بتشغيل معقم الخرز الدقيق للتعقيم بين الجراحة.
2. تخدير الفأر (ذكر أو أنثى، 1.5-2.5 شهر، 20-25 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) لخليط من الكيتامين (17.2 ملغم/مل) والزيلازين (0.475 ملغم/مل) وأسيبرومازين (0.238 ملغم/مل) (6 ميكرولتر/غرام من وزن الجسم). انتظر حتى يتم الوصول إلى عمق التخدير المناسب عندما يتوقف عن الاستجابة لمحفز قرصة إصبع القدم وليس لديه رد فعل القرنية. أثناء الجراحة ، أعط جرعة معززة قدرها 1/3 من الجرعة الأصلية من كوكتيل التخدير حسب الحاجة للحفاظ على حالة التخدير الأصلية.
3. حقن البوبرينورفين تحت الجلد (SC؛ 0.05-0.10 ملغم/كغ) كعامل مسكن قبل الجراحة. ضع مرهما واقيا على عيون لمنع جفاف القرنية وتكوين إعتام عدسة العين.
4. ضع فأرة معدلة وراثيا GCaMP6s على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم وتغطيته بستارة جراحية معقمة. قم بتثبيت رأس باستخدام محول تثبيت الرأس للفئران.
5. احلق الرأس على معظم فروة الرأس بشفرة حلاقة مزدوجة الحواف. نظف منطقة الجراحة بضمادة تحضير كحولية معقمة ، متبوعة بمحلول بوفيدون اليود.

< p class = "jove_title" >2. تحضير نافذة الجمجمة المزمنة

1. قم بعمل قطع مستطيل لفروة الرأس (2 مم × 3 مم) بمقص على جانب واحد (يمين) من الجمجمة. ادفع الجلد جانبا بقطعة قطن لإنشاء منطقة تعرض قطرها >3 مم (الشكل 1 أ). قم بإزالة النسيج الضام المتصل بالجمجمة عن طريق كشط الجمجمة برفق بشفرة جراحية مجهرية حادة (Scalpel Blade # 10; الشكل 1 ج).
2. ضع علامة على منطقة S1 عن طريق رسم دائرة برفق (قطرها 3 مم ، تنسيق المركز: -1.5 مم من بريجما و 2.5 مم من خط الوسط) على الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان (الشكل 2 ب).
3. قم بتنفيذ نفس الإجراء على الجمجمة اليسرى (الشكل 2 ب).
4. ضع طبقة رقيقة من Cyanoacrylate Super Glue على العظم لتوفير قاعدة لتطبيق الأسمنت للأسنان.
5. تحت مجهر تشريح ، قم بتخفيف أخدود دائري في الجمجمة حول منطقة S1 باستخدام مثقاب دقيق عالي السرعة (الشكل 1 د). والغرض من ذلك هو إنشاء حافة ناعمة لوضع نافذة بصرية عليها.
6. ضع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي بشكل متكرر (ACSF ، درجة حرارة الغرفة) على الجمجمة بشكل دوري أثناء عملية التخفيف لتسهيل الحفر وتبديد الحرارة. قم بإجراء الحفر بشكل متقطع لتجنب ارتفاع درجة الحرارة الناجم عن الاحتكاك. امتصاص بقايا العظام باستخدام خط تفريغ المنزل أو مضخة تفريغ.
7. بعد حفر ما يقرب من 2/3 عمق من العظم ، قم بترقيق 1/3 العظم المتبقي ببطء وبعناية حتى تصبح قطعة دائرية من الجمجمة (سديلة عظمية) خالية تماما من الجمجمة المحيطة.
8. قم بإزالة السديلة العظمية الدائرية ببطء وبعناية باستخدام زوج من ملقط # 5/45 وفضح الجافية (الشكل 2 ج ؛ الشكل 1 ه).
9. حافظ على رطوبة منطقة الدماغ المكشوفة باستخدام ACSF (الشكل 1E). تجنب أي ضرر يلحق بالأوعية الدموية لأن النزيف سيغير تدفق الدم الدماغي ، ويسرع من تورم الدماغ ، ويؤدي إلى تدهور شديد في جودة التصوير.
10. قم بتنفيذ نفس الإجراء على الجانب الأيسر (المقابل) من الجمجمة.
11. لتجميع النافذة البصرية ، استخدم مادة لاصقة بصرية للغراء والمعالجة بين طبقات الغطاء الزجاجي واحدة تلو الأخرى. إذا لزم الأمر ، قم بتسخين النافذة البصرية (50 درجة مئوية لمدة 12 ساعة) في حاضنة لتعزيز الترابط اللاصق. تحتوي النافذة البصرية على جزأين: يحتوي الجزء العلوي على غطاء دائري واحد بقطر 5 مم ويحتوي الجزء السفلي على 1-3 أكواب غطاء دائرية بقطر 3 مم (الشكل 2 د).
12. قم بتخزين النافذة البصرية في الإيثانول (70٪ ، حجم / حجم) واشطفها بمحلول ملحي معقم قبل الاستخدام. قبل تثبيت النافذة البصرية ، تحقق من النافذة البصرية بحثا عن عيوب ، بما في ذلك كمية غير صحيحة من المادة اللاصقة البصرية أو المحاذاة غير الدقيقة تحت مجسم الطباعة.
13. قم بتثبيت النافذة البصرية فوق منطقة حج القحف (الشكل 2 د). يقع الجزء العلوي من النافذة البصرية على الجمجمة ، ويتناسب الجزء السفلي من النافذة البصرية مع الفتحة المجهولة ويستقر على الجافية في وجود السائل الدماغي النخاعي (الشكل 2D ، E).
14. أغلق الجزء العلوي من حافة النافذة البصرية بالجمجمة باستخدام الغراء الفائق Cyanoacrylate (الشكل 2F ؛ الشكل 1F).
15. عندما يجف الغراء الفائق Cyanoacrylate ، ضع أسمنت الأسنان الأسود (Dentsply) لتغطية الحافة الزجاجية. ضع أسمنت الأسنان على جميع الجمجمة المكشوفة وهوامش الجرح لحجب الضوء (الشكل 2G-H ؛ الشكل 1 ب).
16. قم بتنفيذ نفس الإجراء على الجانب الأيسر.
17. اسمح للحيوان بالتعافي على وسادة التدفئة وإعادة إلى قفص منزله للتعافي تحت المراقبة المناسبة. قدم طعاما رطبا لتسهيل المضغ والترطيب. لتقليل الألم، يتم تطبيق البوبرينورفين (0.05-2.0 ملغ/كغ) كل 8-12 ساعة بعد الإصابة لمدة يومين. اسمح للماوس بالتعافي لمدة 7-10 أيام إضافية قبل التصوير.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. إنشاء نوافذ ثنائية على الجمجمة. (أ) تظهر صورة فوتوغرافية نافذتين بصريتين في الجمجمة على كل جانب من الجمجمة التي تعلو منطقة S1. (ب) التكبير العالي للمنطقة المعبأة في الصورة (أ) يظهر النوافذ البصرية الثنائية التي تعرض الجافية والأوعية الدموية الكامنة. شريط المقياس = 680 ميكرومتر. (ج) الجمجمة المكشوفة. (د) إنشاء أخدود دائري يظهر فيه سديلة عظمية مركزية. شريط المقياس = 900 ميكرومتر. (ه...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات C57BL / 6J-Tg (Thy1-GCaMP6s) GP4.3Dkim / J جاكسن هاتف: 24275 يمكن أن تكون أي سلالات تصنعها المؤشر العصبي المشفر وراثيا والمستجيب الذي يعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر ، GCaMP ، في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية المثيرة في القشرة. ب 6. Cg-Tg (Thy1-EGFP) OJrs / GfngJ. جاكسن 7919 يمكن أن تكون أي سلالات تعبر عن EGFP في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية داخل مجموعات محددة في القشرة ؛ مما يوفر بقعة مشرقة وحيوية تشبه جولجي. ملقط دومون رقم 5 ، قياسي ، دوموكسل أدوات العلوم الدقيقة 11251-30 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. ملقط دومون رقم 5SF أدوات العلوم الدقيقة 11252-00 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. معقم حبة صغيرة المختبرات الجنوبية ب 1201 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. محول الرأس SG-4N من Harishige أبحاث Tritech SG-4N يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. طقم الحفر الصغير المثالي جهاز هارفارد 72-6065 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. نتوءات للحفر الصغير أدوات العلوم الدقيقة 19007-05 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. غطاء دائري زجاجي ، 3 مم هارفارد للعلوم البيولوجية دبليو 4 64-0720 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. غطاء دائري زجاجي ، 5 مم هارفارد للعلوم البيولوجية دبليو 4 64-0700 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. نورلاند لاصق بصري منتجات نورلاند 7106 ريال يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. Loctite السائل سوبر الغراء دبليو بي ميسون LOC1647358 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. طقم الأسمنت القبضة والمسحوق والمذيبات دنتسبلي 675570 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. امزج 5 أجزاء من مسحوق الأسمنت الأبيض للأسنان (Grip Cement) مع جزء واحد من مسحوق الطلاء الأسود Tempera (للحماية من الضوء ؛ يفضل بعض المستخدمين نسبة 10: 1). رغوة الجل مور الطبية 2928 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. مقص تشريح دقيق روبوز RS-5841 يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارك. السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ASF) - - يحتوي ACSF على 125 ملي كلوريد الصوديوم ، و 4.5 ملي كلوريد الصوديوم ، و 26 ملي مولار من حمض الصوديوم HCO3 ، و 1.25 ملي NaH2PO4 ، و 2 ملي مولار من CaCl2 ، و 1 ملي ملي كلوريد 2 و 20 ملي جلوكوز. قم بتعبئة ACSF بالأكسجين (95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإعداد محلول ACSF جديد قبل كل تجربة.