تسجيل مشبك رقعة الخلية الكاملة في خلية عصبية جيلاتينية جوهرية لشريحة من الحبل الشوكي

الملخص

المصدر: Zhu, M., et al. تحضير شرائح الحبل الشوكي الحادة لتسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة في الخلايا العصبية الجيلاتينية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في الخلايا العصبية الجوهرية الجيلاتينوزا (SG) لشرائح الحبل الشوكي ، باستخدام تقنيات مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحليل أنماط إطلاق الخلايا العصبية. تسمح هذه الطريقة بدراسة الاستجابات العصبية للمنبهات في الخلايا العصبية SG للحبل الشوكي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل المراجعة الأخلاقية المناسبة للحيوانات.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الحلول والمواد

1. محاليل
   1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) (بالملليمتر): 117 كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 3.6 كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 1.2 ثنائي هيدرات فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH₂PO₄ · 2 H₂O) ، 2.5 ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl₂ · 2 H₂O) ، 1.2 سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂ · 6 H₂O) ، 25 بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) ، 11 د جلوكوز ، 0.4 حمض الأسكوربيك ، و 2 بيروفات الصوديوم. انظر الجدول 1.
   2. تحضير محلول داخل الخلايا قائم على K ⁺ (بالمللي مولار): 130 كلورين غلوكونات ، 5 كيلو كلوريل ، 10 Na_{2-فوسفوكرياتين} ، 0.5 إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N ′ - حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ، 10 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 4 أدينوزين ثلاثي فوسفات المغنيسيوم (Mg-ATP) ، و 0.3 ليثيوم جوانوزين ثلاثي فوسفات (Li-GTP). انظر الجدول 2.
   3. تحضير محلول داخل الخلايا القائم على السيزيوم (Cs ⁺) (بالملليمتر): 92 سلفونات ميثان السيزيوم (CsMeSO₄) ، 43 كلوريد السيزيوم (CsCl) ، 10 Na 2-phosphocreatine ، 5 رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA) -Cl ، 0.5 EGTA ، 10 HEPES ، 4 Mg-ATP ، و 0.3 Li-GTP. انظر الجدول 3.
      ملاحظه: يجب تحضير جميع المحاليل باستخدام الماء المقطر. يجب أن يكون ACSF و sucrose-ACSF كربوجينيا (خليط 95٪ O₂ و 5٪ CO₂) قبل الاستخدام للحفاظ على درجة حموضة مثالية تبلغ حوالي 7.4 ، ويجب تعديل الأسمولية لهذين المحلولين إلى 300-310 مللي أوسمول (mOsm). نظرا لأن حمض الأسكوربيك يمكن أن يؤثر على قنوات الكالسيوم ، يجب حذف هذا العامل إذا رغب المرء في تسجيل تيارات الكالسيوم. يجب قياس الأسمولية ودرجة الحموضة في المحاليل داخل الخلايا وتعديلها إلى 290-300 مللي أسمول في المتر المربع و 7.2-7.3 على التوالي. يوصى بتصفية المحاليل داخل الخلايا بمرشحات 0.2 ميكرومتر وتخزين المحاليل على شكل حصات 1 مل عند -20 درجة مئوية. يتم تطبيق Cs ⁺ و TEA في محلول داخل الخلايا القائم على Cs ⁺ لمنع قناة البوتاسيوم ، مما يساعد على استخدام مكبر الصوت للحفاظ على ثبات جهد الغشاء عند 0 مللي فولت عند تسجيل التيارات المثبطة بعد المشبكي (IPSCs).
2. الصكوك
   1. بالنسبة لنظام الفيزيولوجيا الكهربية النموذجي، استخدم مجهرا عموديا مزودا بتباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) وهدف غمر الماء عالي الدقة، وكاميرا CCD/CMOS، ومكبر صوت مشبك رقعة، وحامل ماصة دقيقة، ومعالج دقيق يسمح بالضبط الدقيق لموضع الماصة. هناك حاجة أيضا إلى مرحلة XY لتحريك المجهر.
   2. قم بتركيب جميع المعدات على طاولة عزل الاهتزاز محاطة بقفص فاراداي. قم بتوصيل شاشة فيديو بكاميرا الفيديو لمراقبة الخلايا العصبية وتصور الماصات الدقيقة.
3. الماصات الدقيقة
   1. اصنع أقطاب تسجيل من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. تتراوح مقاومة الماصة النموذجية من 3-6 MΩ عند ملؤها بمحلول داخل الخلايا.

< p class = "jove_title" >2. تسجيلات مشبك التصحيح للخلية

الكاملة

1. لإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية الجوهرية الجيلاتينوزا (SG) ، استخدم الحل داخل الخلايا المستند إلى K ⁺ لمعظم حالات التسجيل أثناء تطبيق الحل المستند إلى Cs ⁺ فقط لتسجيل التيارات المثبطة بعد المشبكي.
2. حرك شريحة الحبل الشوكي برفق إلى غرفة التسجيل ، ثم حافظ عليها بسلك بلاتيني على شكل حرف U متصل بخيوط نايلون بإحكام لتحقيق الاستقرار الأمثل للشريحة. قم ببث الشريحة بثبات باستخدام ACSF الفقاعي في RT من خلال نظام الجاذبية واضبط معدل التروية على 2-4 مل / دقيقة لتحقيق أكسجة كافية.
3. حدد منطقة SG (نطاق شفاف) باستخدام عدسة مجهرية منخفضة الدقة ، واختر خلية عصبية سليمة باستخدام الهدف عالي الدقة كخلية مستهدفة ، واضبطها على مركز شاشة شاشة الفيديو.
4. املأ ماصة دقيقة بحجم مناسب من المحلول داخل الخلايا القائم على K⁺ أو Cs ⁺ حسب الحاجة، وأدخل الماصة الدقيقة في حامل القطب الكهربائي، وتأكد من أن المحلول داخل الخلايا يلامس السلك الفضي داخل الحامل.
5. اجعل الماصة الدقيقة في بؤرة التركيز ، واغمرها في ACSF باستخدام معالج دقيق ، ثم قم بتطبيق ضغط إيجابي معتدل (~1 رطل لكل بوصة مربعة عند القياس باستخدام مقياس ضغط) لإجبار الماصة الدقيقة على الابتعاد عن أي أوساخ وحطام.
6. حرك الماصة الدقيقة نحو الخلايا العصبية المستهدفة تدريجيا. حرر الضغط الإيجابي بمجرد اقتراب الماصة من الخلايا العصبية ، وتتشكل غمازة صغيرة جدا على الغشاء العصبي لتشكيل جيجاسيل.
7. قم بتغيير إمكانات الاحتفاظ إلى -70 مللي فولت ، وهو قريب من إمكانات غشاء الراحة الفسيولوجية (RMP) للخلية. بعد ذلك، قم بتطبيق شفط عابر ولطيف على الماصة الدقيقة لتمزق الغشاء وإنشاء تكوين جيد للخلية الكاملة.
   ملاحظه: بعد نقل الشريحة إلى غرفة التسجيل ، تأكد من التروية الثابتة لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة الحطام على سطح الشريحة. تجدر الإشارة إلى أن القدرة على التمييز بين الخلايا العصبية السليمة وغير الصحية / الميتة لها أهمية قصوى للختم الجيد والتسجيل المستقر. الخلايا العصبية غير الصحية / الميتة لها مظهر منتفخ أو منكمش ، جنبا إلى جنب مع نواة كبيرة مرئية ، بينما تتميز الخلايا العصبية السليمة بشكل ثلاثي الأبعاد (3D) مع غشاء لامع وسلس ، ونواتها غير مرئية. لتحقيق تكوين خلية كاملة ، من الضروري تعويض السعة السريعة أو البطيئة خطوة بخطوة عند الضرورة. في درجة حرارة الغرفة (RT) ، يتم حساب جهد الوصلة السائلة لتكون 15.1-15.2 مللي فولت (mV) و 4.3-4.4 مللي فولت في المحاليل داخل الخلايا القائمة على K ⁺ و Cs ⁺ ، على التوالي. في دراساتنا ، لم يتم تصحيح البيانات المسجلة لإمكانات التوصيل السائل.
8. تسجيلات خصائص الغشاء الجوهري
   1. سجل خصائص إطلاق النار: اختبر نمط إطلاق النار لكل خلية عصبية في المشبك الحالي بسلسلة من نبضات تيار إزالة الاستقطاب 1 ثانية (25-150 بيكوأمبير (pA) بزيادة 25 pA) عند RMP. قم بقياس العتبة والسعة ونصف العرض لجهد إجراء واحد في وضع عدم الاتصال.

الجدول 1: وصفة ACSF

مكون وزن جزيئي التركيز (مللي متر) جم / لتر كلوريد الصوديوم 58.5 117 6.84 دولار كيه سي إل 74.5 دولار 3.6 [إ] 0.27 NaH2PO4 · 2H2O 156 1.2 0.19 CaCl2 · 2H2O 147 2.5 0.37 MgCl2 · 6 ساعة 2 203 1.2 0.24 NaHCO3 84 25 2.1 د-جلوكوز 180 11 1.98 حمض الأسكوربيك 198.11 دولار 0.4 0.08 بيروفات الصوديوم 110 2 0.22

الجدول 2: وصفة للحل داخل الخلايا القائم على K ⁺

مكون وزن جزيئي التركيز (مللي متر) ملغ/100 مل ك-غلوكونات 234.2 [إ] 130 3044.6 كيه سي إل 74.5 دولار 5 37.28 دولار Na2-فوسفوكرياتين 453.38 دولار 10 453.38 دولار EGTA 380.35 دولار 0.5 19.02 دولار هيبس 238.31 دولار 10 238.3 [إ] مجم - ATP 507.18 [إ] 4 202.9 ليثيوم جي تي بي 523.18 دولار 0.3 15.7 دولار

الجدول 3: وصفة لمحلول داخل الخلايا القائم على Cs ⁺

مكون وزن جزيئي التركيز (مللي متر) ملغ/100 مل سي إس ميزو 4 228 92 2097.6 سي إس إل 168.36 دولار 43 723.95 Na2-فوسفوكرياتين 453.38 دولار 10 453.38 دولار شاي-كلوريد 165.71 دولار 5 82.86 دولار EGTA 380.35 دولار 0.5 19.02 دولار هيبس 238.31 دولار 10 238.3 [إ] مجم - ATP 507.18 [إ] 4 202.9 ليثيوم جي تي بي 523.18 دولار 0.3 15.7 دولار

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم سيغما إس 7653 تستخدم لإعداد ACSF و PBS كيه سي إل سيغما 60130 تستخدم لتحضير محلول داخل الخلايا القائم على ACSF و sukrose-ACSF و K + NaH2PO4 · 2H2O سيغما 71500 تستخدم لتحضير ACSF و sucrose-ACSF و PBS CaCl2 · 2H2O سيغما سي 5080 تستخدم لتحضير ACSF والسكروز-ACSF MgCl2 · 6 ساعة 2 سيغما M2670 تستخدم لتحضير ACSF والسكروز-ACSF NaHCO3 سيغما الطراز S5761 تستخدم لتحضير ACSF والسكروز-ACSF د-جلوكوز سيغما جي 7021 تستخدم لإعداد ACSF حمض الأسكوربيك سيغما ص 5280 تستخدم لتحضير ACSF والسكروز-ACSF بيروفات الصوديوم سيغما أ 7631 تستخدم لتحضير ACSF والسكروز-ACSF سكروز سيغما إس 7903 تستخدم لتحضير السكروز-ACSF ك-غلوكونات واكو 169-11835 تستخدم لتحضير محلول داخل الخلايا القائم على K + Na2-فوسفوكرياتين سيغما ص 1937 تستخدم لإعداد محلول داخل الخلايا EGTA سيغما E3889 تستخدم لإعداد محلول داخل الخلايا هيبس سيغما إتش 4034 تستخدم لإعداد محلول داخل الخلايا مجم - ATP سيغما أ 9187 تستخدم لإعداد محلول داخل الخلايا ليثيوم جي تي بي سيغما جي 5884 تستخدم لإعداد محلول داخل الخلايا سي إس ميزو 4 سيغما ج1426 تستخدم لتحضير محلول داخل الخلايا القائم على Cs + سي إس إل سيغما سي 3011 تستخدم لتحضير محلول داخل الخلايا القائم على Cs + شاي-كلوريد سيغما تي 2265 تستخدم لتحضير محلول داخل الخلايا القائم على Cs + Na2HPO4 الكواشف الكيميائية Hengxing تستخدم لإعداد PBS الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات أدوات الدقة العالمية TW150F-4 1.5 مم OD ، 1.12 مم معرف مجتذب الماصات الدقيقة أداة سوتر ف-97 تستخدم لإعداد الماصات الدقيقة كاميرا CCD بالأشعة تحت الحمراء داج-معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا IR-1000 مكبر للصوت مشبك التصحيح هيكا EPC-10 معالج دقيق أداة سوتر النائب 285 مرحلة XY بيرلي جبل طارق XY مجهر عمودي أوليمبوس BX51WI مقياس التناضح متقدم فيسك 210 مقياس الأس الهيدروجيني ميتلر توليدو FE20