استجابات ما بعد المشبكي المضطربة بالضوء في الخلايا العصبية لشرائح شبكية الفأر

الملخص

المصدر: Hellmer، C. B.، et al. تسجيل استجابات ما بعد المشبكي المستحثة بالضوء في الخلايا العصبية في مستحضرات شريحة شبكية العين المتقدمة مع الظلام باستخدام تقنيات مشبك التصحيح. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تسجيل استجابات ما بعد التشابك المبدأة بالضوء في تحضير شريحة أنسجة شبكية العين المائية المتأثرة بالظلام. يتم وضع شريحة الشبكية في غرفة التسجيل ، ويتم استخدام ماصة التسجيل لإنشاء استمرارية كهربائية مع خلية عقدية شبكية. يتم تطبيق نبضات الضوء لتوليد إمكانات ما بعد التشابك المثيرة في الخلايا العقدية ، والتي يتم تسجيلها بواسطة الماصة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. تحضير الحل التجريبي

1. تحضير محلول التشريح قبل يوم إلى أسبوع واحد من التجربة الفعلية. استخدم محلول عازل 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينيثان سلفونيك (HEPES) لتشريح الشبكية بسبب قدرته القوية على التخزين المؤقت في درجات الحرارة المنخفضة16. تخلط جميع المواد الكيميائية على النحو التالي (بالملليمتر): 115 كلوريد الصوديوم ، 2.5 كلوريد كلوريد ، 2.5 كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 1.0 ملغم كلوريد₂ ، 10 هيبلز ، 28 جلوكوز. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. احتفظ بالمحلول في الثلاجة لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
2. حل التسجيل هو وسيط أميس ، وهو سائل نخاعي دماغي اصطناعي (aCSF) مصمم لمستحضرات الشبكية. بحلول يوم التجربة ، قم بوزن مسحوق أميس (4.4 جم لمحلول 500 مل) في أنبوب. أيضا ، قم بوزن NaHCO₃ (0.95 جم لمحلول 500 مل) واخلطه مع مسحوق أميس.
3. قم بإعداد محلول الماصة داخل الخلايا لتسجيلات مشبك التصحيح بحلول يوم التجربة. امزج جميع المواد الكيميائية على النحو التالي (بالملليمتر): 111 كلوريد كلوريد ، 1.0 كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 10 هيبس ، 1.1 حمض رباعي أسيتيك الإيثيلين جلايكول (EGTA) ، 10 كلوريد الصوديوم ، 1.0 ملجمكلوريد_{الصوديوم 2} ، 5 ATP-Mg ، و 1.0 GTP-Na. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام KOH. قم بتصفية محلول الماصة باستخدام مرشح حقنة تقليدي. اصنع ~ 500 ميكرولتر من الحصص وقم بتخزينها في الفريزر أو الفريزر العميق.

< p class = "jove_title" >2. التحضير ليوم التجربة

1. في الليلة السابقة للتجربة ، ضع الفأر في قفص (C57BL / 6J أو خلفية مماثلة ، من 4 إلى 8 أسابيع ، ذكر) في مكان مظلم للتكيف المظلم بين عشية وضحاها.
2. التحضير للتشريح:
   1. املأ محلول التشريح (100-200 مل) في دورق زجاجي ، وضعه على الثلج ، واتركه بالأكسجين لمدة 10 دقائق على الأقل.
   2. ابدأ أكسجة الصندوق المظلم لتخزين تحضير الشبكية.
   3. قم بإعداد أغطية بلاستيكية بقضبان شحوم لتحضير شرائح الشبكية وضع كل منها في طبق بلاستيكي مقاس 35 مم.
   4. قم بتوصيل شفرة حلاقة جديدة بمفرمة (قطاعة الأنسجة).
   5. قطع غشاء المرشح إلى نصفين. هذا لتقطيع الشبكية.
   6. قم بمحاذاة أدوات التشريح ونقل الماصات بالقرب من مجهر التشريح. يجب أن تكون منطقة العمل منظمة جيدا بحيث يمكن الوصول إلى كل أداة بسهولة في الظلام.
3. التحضير لتسجيلات مشبك التصحيح:
   1. قم بإذابة مسحوق أميس و NaHCO₃ في الماء المقطر (أميس 4.4 جم و NaHCO₃ 0.95 جم / 500 مل ddH₂O). قم بفقاعة وسط أميس بالأكسجين المختلط (95٪ O₂ و 5٪ CO₂) لمدة 30 دقيقة على الأقل أثناء التسخين إلى مستوى درجة حرارة التسجيل (~ 35 درجة مئوية). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaHCO₃ بينما لا يزال يغلي الغليانات.
   2. قم بإذابة محلول الماصة الداخلي أثناء التشريح. بعد إذابته ، أضف 0.01٪ سلفورهودامين ب للتلوين داخل الخلايا.

3. تسجيلات مشبك التصحيح من إعداد شريحة الشبكية

1. إعداد التسجيل:
   1. قم بتجهيز أنابيب التروية بوسط أميس. اسمح لجميع الفقاعات بالمرور عند ملء الأنبوب.
   2. اصنع ماصات تسجيل مشبك التصحيح باستخدام مجتذب. لملء الماصة بمحلول الماصة، اغمس في الجزء الخلفي من الماصة لمدة 1 دقيقة حتى يتم ردم طرف الماصة. بعد ذلك، املأ ~ 1/3 من الماصة باستخدام حشو ماصة دقيقة. قم بتخزين كل ماصة في صندوق ماصة رطب.
   3. قم بتشغيل الجهاز لتسجيلات مشبك التصحيح ، بما في ذلك الكمبيوتر ومكبر الصوت وكاميرا الجهاز المقترن بالشحن (CCD) والمجهر.
2. أطفئ ضوء الغرفة. ضع شريحة الشبكية على حجرة المسرح المجهرية باستخدام عارض الأشعة تحت الحمراء. بعد تجميدها ، ابدأ التروية المستمرة. اضبط درجة حرارة التروية على 33 إلى 37 درجة مئوية.
3. اعرض سطح الشريحة باستخدام كاميرا CCD. ركز على الموقع المستهدف حيث توجد أنواع الخلايا المستهدفة. حدد خلية ذات مظهر صحي لتسجيل مشبك التصحيح (على سبيل المثال ، يجب أن يكون لها سطح أملس المظهر وشكل خلية جيد).
4. ضع ماصة التسجيل في حامل الماصة. ادفع الماصة إلى تحضير الشريحة. عندما تكون قريبة من تحضير الشريحة (~ 2 مم أعلاه) ، ابحث عن طرف الماصة بالمجهر. بمجرد أن يصبح طرف الماصة مرئيا تحت المجهر ، حرك الطرف لأسفل باتجاه الخلية المستهدفة.
5. اضبط مكبر الصوت. اضبط الماصة عند 0 مللي فولت / 0 باسكال (تصفير) وابدأ نبضة كهربائية مستمرة ~ 5 مللي فولت عند ~ 10 هرتز. تحقق من مقاومة الماصة ؛ تتراوح المقاومة المثالية بين 5 و 10 MΩ لمعظم الخلايا العصبية في الشبكية.
6. ابدأ في النفخ من الحافة. استخدم قطعة لسان حال أو استخدم حقنة لممارسة الضغط الإيجابي عندما تنخفض الماصة في محلول الحمام. قم بتفجير المحلول الداخلي باستمرار حتى يصبح الطرف على سطح الخلية المستهدفة.
   1. عندما يتسبب الضغط الإيجابي في ظهور غمازة صغيرة على سطح الخلية ، قم بتقديم الطرف قليلا وتوقف عن النفخ. تحقق من مقاومة الماصة ، والتي يجب أن تزداد. إذا كان يتزايد باستمرار ، اتركه وراقب المقاومة حتى تصل إلى >1 GΩ (gigaseal). إذا لم تزداد المقاومة تلقائيا ، فقم بالضغط السلبي برفق حتى يصبح جيجاسيل.
7. بعد تحقيق gigaseal ، قم بتغيير إمكانات التثبيت إلى -70 مللي فولت. بعد ذلك، قم بالضغط السلبي بشكل متقطع لتمزق الغشاء داخل طرف الماصة. عند إجراء تكوين الخلية بأكملها، يمكن أن تتراوح مقاومة الماصة بين 500 MΩ و 1 GΩ، ويظهر التيار السعوي. في بعض الأحيان يمكن ملاحظة تيارات ما بعد المشبكي العفوية.
8. سجل علاقة التيار والجهد (IV) من -80 إلى +40 مللي فولت. يتم تنشيط أنواع مختلفة من القنوات ذات الجهد الكهربائي اعتمادا على نوع الخلية.
9. سجل التيارات أو الفولتية المشبكية التي يثيرها الضوء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الفئران (28-60 يوما ، ذكور) مختبر جاكسون سلالة C57BL / 6J مسحوق أميس المتوسط سيغما أ 1420 ممتازة عارض الأشعة تحت الحمراء بصريات البومة الليلية نوبج 1 يظهر رؤية مشرقة. تركيز الأشياء الصغيرة هو مشكلة. نطاقات الجيب بالأشعة تحت الحمراء بي إي مايرز منظار الجيب OWL Gen 3 NV منظر ممتاز ساحبه سوتر ف -1000 ممتازة. اصنع ماصات ذات حجم متناسق. الصندوق المظلم بجع الصندوق المظلم ممتازة نظام مشبك التصحيح علمية نطاق الشريحة 2000 إعداد ممتاز. يتم تضمين معظم المكونات الرئيسية في حزمة واحدة. المتلاعبون الدقيقة ممتازة. مكبر الأجهزة الجزيئية متعدد المشبك 700B تحكم ممتاز وسهل. الحصول على البرمجيات الأجهزة الجزيئية برنامج pClamp تحكم ممتاز وسهل. مصدر الضوء (LED) LED بارد pE-2 نظام 4 قنوات ممتازة كاميرا CCD تصوير Q ريتيجا 2000 ممتازة قفص فاراداي اليدويه