$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. نضح عبر القلب
- قم بتعليق حقنة بسعة 60 مل كخزان لمحلول قطع السكروز على ارتفاع 18 بوصة تقريبا فوق سطح الطاولة (على سبيل المثال ، باستخدام مشبك دوار ثلاثي المحاور على عمود عمودي). قم بتوصيل الأنبوب بالجزء السفلي من الخزان ، وقم بتشغيل الأنبوب من خلال مشبك أسطواني ، وقم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بإبرة نظيفة 20 جراما.
- املأ الخزان سعة 60 مل بحوالي 30 مل من محلول السكروز المبرد وقم بتوجيه خط الكربوجين إلى خزان السكروز لإخراج الرقاقة باستمرار.
ملاحظه: تأكد من أن السكروز يتدفق عبر الأنبوب والإبرة دون أي فقاعات محاصرة. يجب أن يكون معدل التدفق سريعا بما يكفي للحصول على تيار ثابت ومستمر من السكروز المتساقط من الإبرة.
- باستخدام الخلاط ، سحق السكروز المجمد واخلطه في ملاط مثلج واستخدم الملعقة / الملعقة الكبيرة لتوزيع الملاط.
- ضع كمية صغيرة من ملاط السكروز حول حواف غطاء طبق بتري الزجاجي. أضف كمية صغيرة من ملاط السكروز إلى قاع طبق بتري.
- أضف ما يقرب من 20-30 مل من ملاط السكروز إلى خزان سائل التروية ، واخلطه جيدا مع 30 مل من السكروز السائل المبرد حتى يحتوي الخزان على خليط من السكروز شديد البرودة ، والذي يغلب عليه السائل مع بعض المحلول المجمد المتبقي.
- ضع الماوس في غرفة متصلة بمبخر الأيزوفلوران. مع تدفق الأكسجين بحوالي 2 لتر / دقيقة ، أدر قرص المرذاذ لتوصيل الأيزوفلوران بتركيز 5٪ وابدأ مؤقتا.
ملاحظه: استمر في استمرار هذا المؤقت طوال فترة التقطيع لقياس مدى سرعة الحصول على الشرائح. يجب أن يتم الإجراء في أسرع وقت ممكن ، بحيث يكتمل التقطيع ، ويتعافى الأنسجة في غرفة الواجهة في غضون 15-20 دقيقة من دخول إلى غرفة الأيزوفلوران. راقب الماوس لضمان تحقيق حالة من التخدير العميق. بعد 5 دقائق على الأقل ، يجب تخدير الماوس بعمق وعدم الاستجابة لقرصات أصابع القدم.
- مباشرة قبل إخراج الفأر من غرفة الأيزوفلوران ، املأ غطاء طبق بتري بمحلول السكروز المبرد على عمق حوالي 3-5 مم واملأ قاع طبق بتري بمحلول السكروز المبرد على عمق 1.0 سم تقريبا.
- انقل الماوس بسرعة إلى وسادة الامتصاص اليسرى واستخدم 3 قطع من الشريط اللاصق لتأمين الأطراف الأمامية والذيل. قم بإجراء قرصة إصبع القدم الخلفي للتأكد من أن الفأر لا يستجيب قبل إجراء أي شق. باستخدام ملقط الأنسجة الكبيرة والمقص الجراحي ، قم بتثبيت الجلد وقم بعمل شق طولي من أسفل القص إلى أعلى الصدر. باستخدام الملقط ، اسحب القص واستخدم المقص لقطع الحجاب الحاجز.
ملاحظه: يجب إجراء الوضع الأولي للفأر والشقوق العديدة الأولى لقطع الحجاب الحاجز في أسرع وقت ممكن لضمان عدم استعادة الفأر للوعي. لضمان عمق كاف للتخدير طوال العملية ، يمكن وضع مخروط الأنف على الفأر لتوصيل الأيزوفلوران أثناء التروية.
- استخدم المقص لقطع القفص الصدري على كل جانب ، وقطع بحركة واحدة كبيرة نحو النقطة التي يلتقي فيها الطرف الأمامي بالجسم. باستخدام الملقط ، قم بتأرجح الجزء الأمامي من القفص الصدري بعيدا وأعلى باتجاه الرأس ، ثم قم بإزالته بالكامل بقطع أفقي باستخدام مقص كبير. أمسك القلب في مكانه باستخدام ملقط كبير وأدخل إبرة التروية 20 جم في البطين الأيسر. بمجرد وضع الإبرة بشكل صحيح ، يجب أن يتلاشى الجانب الأيسر من القلب بسرعة حيث يملأ محلول السكروز المبرد البطين.
- استخدم مقص التشريح الصغير لقطع الأذين الأيمن والسماح للدم بالتدفق خارج الدورة الدموية. إذا تم إجراء الشقوق بشكل صحيح ، فيجب أن يكون هناك الحد الأدنى من الضرر للقلب ، ويجب أن يستمر في الضخ طوال فترة التروية.
ملاحظه: يمكن استخدام قطع المناديل الورقية الملفوفة لامتصاص الدم ومحلول السكروز من القلب والحفاظ على رؤية إبرة التروية أثناء العملية.
- تأكد من بقاء إبرة التروية في مكانها وعدم سقوطها من البطين الأيسر. مع معدل التدفق المناسب والموضع ، سيبدأ الكبد في الاحشاب إلى اللون البني الفاتح / البيج مع 20-30 ثانية.
- بعد 30-45 ثانية ، استخدم المقص الكبير لقطع رأس الماوس. أمسك الرأس باليد اليسرى ، وادفع الجلد أو قشره بعيدا عن الجمجمة. في جيد الانتشار ، يجب أن تكون الجمجمة شاحبة جدا ، ويجب أن يظهر الدماغ بلون وردي فاتح جدا (يقترب من الأبيض) من خلال الجمجمة دون وجود أوعية دموية مرئية بوضوح.
< p class = "jove_title" >
2. استخرج الدماغ وقطع الشرائح
- باستخدام مقص بون الصغير ، قم بعمل قطعتين جانبيتين عبر الجمجمة باتجاه خط الوسط في مقدمة الجمجمة ، بالقرب من العينين. قم بعمل قطعتين إضافيتين على جانبي قاعدة الجمجمة.
- انقل الرأس إلى قاع طبق بتري الزجاجي حيث يجب غمره في الغالب في محلول السكروز المبرد. استخدم مقص بون الصغير لقطع خط الوسط على طول الجمجمة ، وسحب المقص لتقليل الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ الأساسية. باستخدام ملقط الأنسجة الصغير ، أمسك بإحكام كل جانب من الجمجمة وقم بتأرجحه لأعلى وبعيدا عن الدماغ ، مثل فتح كتاب.
- استخدم أصابع اليد اليسرى لإبقاء سدائل الجمجمة مفتوحة وأدخل الملعقة الدقيقة أسفل الدماغ بالقرب من المصابيح الشمية. اقلب الدماغ من الجمجمة إلى السكروز واستخدم الملعقة الدقيقة لقطع جذع الدماغ. اغسل الدماغ لإزالة أي دم أو فراء أو أنسجة أخرى متبقية.
- استخدم الملعقة الكبيرة / الملعقة لنقل الدماغ إلى غطاء طبق بتري الزجاجي. مع وضع النصف الآخر من شفرة الحلاقة ذات الحدين جانبا مسبقا ، قم بعمل قطعتين إكليليتيين لإزالة المخيخ أولا ثم الجزء الأمامي من الدماغ ، بما في ذلك البصيلات الشمية (الشكل 1).
- ضع مادة لاصقة cyanoacrylate على منحدر أجار. ضع الدماغ لفترة وجيزة جدا على قطعة من ورق الترشيح الجاف باستخدام ملقط الأنسجة الكبيرة ثم انقله على الفور إلى منحدر أجار ، ووضع السطح البطني للدماغ على المادة اللاصقة.
ملاحظه: بالنسبة لشرائح الحصين الوسيط ، يجب توجيه الدماغ بحيث يكون الجزء الأمامي مواجها لأعلى منحدر المنحدر ، والجزء الخلفي أقرب إلى النصل. بالنسبة لشرائح الحصين البطني ، قم بتوجيه الدماغ مع توجيه الطرف الأمامي إلى أسفل منحدر المنحدر ، مع الطرف الخلفي في الجزء العلوي من المنحدر ، بعيدا عن الشفرة. في كلتا الحالتين ، يجب وضع الدماغ في الجزء العلوي من المنحدر ، بحيث يلامس سطح الدماغ المقطوع إكليليا كتلة دعم الأجار (الشكل 1).
- ضع منصة التقطيع مع الأجار والدماغ في غرفة التقطيع في الميكروتوم واغمرها تماما بمحلول السكروز المبرد. استخدم الملعقة الكبيرة / الملعقة لنقل بعض ملاط السكروز إلى الغرفة ، مع التحريك لإذابة أي سكروز مجمد وخفض درجة حرارة الخليط بسرعة إلى ~ 1-2 درجة مئوية><.
ملاحظه: راقب مقياس درجة الحرارة طوال عملية التقطيع. إذا ارتفعت درجة حرارة محلول السكروز فوق 3 درجات مئوية ، أضف المزيد من الملاط واخلطه لخفض درجة الحرارة مرة أخرى.
- قطع الشرائح بسمك 450 ميكرومتر مع ضبط سرعة الميكروتوم على 0.07 مم / ثانية. عندما يتم تحرير كل شريحة ، استخدم ملقط الأنسجة الصغيرة ومشرط حاد لفصل نصفي الكرة الأرضية أولا ، ثم لقطع الأنسجة حتى تتكون الشريحة بشكل أساسي من الحصين ومناطق الحصين (الشكل 1).
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل الشرائح بشكل فردي إلى غرفة استرداد الواجهة ، مما يضمن وضعها في واجهة ACSF والهواء مع وجود غضروف مفصلي رفيع فقط من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) يغطي الشرائح. أغلق غطاء الغرفة بإحكام واترك الشرائح تتعافى عند 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الاسترداد الأولي عند 32 درجة مئوية ، أخرج غرفة استرداد الواجهة من الحمام المائي وضعها على محرك مضبوطة على سرعة بطيئة بحيث يعزز شريط التحريك المغناطيسي دوران ACSF داخل الغرفة. اتركه ليبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة حيث تتعافى الشرائح لمدة 90 دقيقة إضافية. تأكد من أن غرفة الاسترداد مليئة بالكربوجين باستمرار ولا تسمح للفقاعات الكبيرة بأن تصبح محاصرة تحت الشرائح.
3. إجراء تسجيلات المجال المحلي المحتمل (LFP) للنشاط التلقائي
- استعد لتسجيلات LFP عن طريق تشغيل جميع المعدات اللازمة ، بما في ذلك الكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج الاستحواذ ، والشاشة المتصلة بالكمبيوتر ، والمحفزات ، ومعالج الدقيق ، وجهاز التحكم في درجة الحرارة ، ومصدر ضوء المجهر ، والكاميرا المتصلة بالمجهر ، ومضخم القطب الكهربائي الدقيق ، والمحول الرقمي ، والمضخة التمعجية. إذا كنت تستخدم نظام تفريغ مركزي ، فافتح صمام الحائط لإعداد خط التفريغ الذي سيزيل ACSF من غرفة التسجيل.
- املأ الخزان الساخن ب ACSF ، ثم ضع أحد طرفي الأنبوب في دورق 400 مل الذي يحتوي على ACSF الفقاعي. قم بتشغيل المضخة التمعجية لتوجيه ACSF من الدورق سعة 400 مل إلى الخزان الساخن ، ومن الخزان فصاعدا إلى غرفة التسجيل. اضغط على الأنبوب أو اضغط عليه لتحرير أي فقاعات محاصرة.
- اضبط المضخة التمعجية للتأكد من أن معدل تدفق ACSF عبر غرفة التسجيل سريع (~ 8-10 مل / دقيقة). استخدم مسبار درجة الحرارة للتأكد من أن ACSF هو 32 درجة مئوية في وسط غرفة التسجيل.
ملاحظه: إذا تم تسليم ACSF إلى غرفة التسجيل باستخدام مضخة تمعجية ، فقد يؤدي معدل التدفق المرتفع إلى تذبذب كبير في معدل التدفق. يمكن تحقيق معدلات تدفق متسقة باستخدام مخمد نبض بسيط يتكون من سلسلة من المحاقن الفارغة المدمجة في الأنبوب (الشكل 2).
- قم بإعداد ماصات التحفيز والتسجيل من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب خيوط ساخنة. يجب تكوين بروتوكول الساحب لإنتاج ماصات بمقاومة 2-3 MOhm للتحفيز أو أقطاب تسجيل إمكانات المجال المحلي.
- املأ ماصات التحفيز بماصات كلوريد الصوديوم 1 M و LFP باستخدام ACSF.
- قم بتثبيت الأنبوب لفترة وجيزة وإيقاف تشغيل المضخة لإيقاف تدفق ACSF مؤقتا. انقل شريحة إلى غرفة التسجيل باستخدام ملقط دقيق لإمساك زاوية من ورق العدسة الذي تستقر عليه الشريحة - ستلتصق الشريحة بورق العدسة. ضع ورق العدسة وقم بتقطيعه إلى غرفة التسجيل بحيث تكون الشريحة متجهة لأسفل، ثم "قشر" ورق العدسة بعيدا عن ترك الشريحة مغمورة في حجرة التسجيل. قم بتأمين الشريحة باستخدام قيثارة.
ملاحظه: يمكن شراء القيثارة مسبقة الصنع أو تصنيعها في المختبر باستخدام قطعة على شكل حرف U من الفولاذ المقاوم للصدأ أو خيوط البلاتين والنايلون الناعم.
- ضع ماصة تحفيز مملوءة بكلوريد الصوديوم في المعالج الدقيق اليدوي وقم بدفع طرف الماصة ببطء إلى سطح الشريحة (على سبيل المثال، في طبقة الطبقة الرادياتومية) بزاوية تقارب 30-45 درجة. بمجرد دخول طرف الماصة إلى الأنسجة، ادفع الماصة للأمام ببطء وامتنع عن الحركات الكبيرة في الاتجاه الجانبي أو الرأسي التي يمكن أن تلحق الضرر بالمحاور داخل الشريحة دون داع. ضع طرف الماصة بعمق 50-100 ميكرومتر على الأقل في الشريحة لتجنب الخلايا القريبة من السطح التي تعرضت للتلف أثناء التقطيع.
- ضع ماصة LFP مملوءة ب ACSF في حامل الماصة المتصل بجهاز المعالجة الدقيقة الآلي. ضع ضغطا إيجابيا خفيفا جدا باستخدام ضغط الفم أو محقنة سعة 1 مل متصلة عبر صمام محبس وطول قصير من الأنابيب بحامل الماصة.
ملاحظه: ضع ماصات LFP داخل الشريحة لتسجيل الإشارات ذات الأهمية: في حالة التموجات الحادة، يجب وضع ماصة LFP واحدة في الطبقة الهرمية (SP) وماصة ثانية في الطبقة الرادياتية (SR). يسمح هذا التكوين بتسجيلات متزامنة للموجة الحادة السالبة في SR وتذبذب التموج عالي التردد في SP (الشكل 3).
- باستخدام المعالج الدقيق ، قم بدفع طرف ماصة LFP ببطء إلى منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، طبقة الخلية الهرمية CA1) بزاوية 30-45 درجة تقريبا. ضع طرف الماصة بعمق 50-100 ميكرومتر على الأقل في الشريحة لتجنب الخلايا القريبة من السطح التي تعرضت للتلف أثناء التقطيع. أثناء تطوير ماصة LFP، قم باستمرار بتوصيل نبضة اختبار جهد صغير باستخدام برنامج الاستحواذ وراقب الزيادة المفاجئة في مقاومة القطب الكهربائي. قد يشير هذا إلى أن الماصة قد تم انسدادها أو ضغطها على خلية.
- بمجرد وضع ماصة LFP في المنطقة المعنية، حرر الضغط الإيجابي بعناية عن طريق فتح الصمام الموجود على الأنبوب المتصل بحامل الماصة.
- لتسجيل LFP في موقع ثان في وقت واحد، كرر الخطوات 6.8-6.10 باستخدام ماصة ثانية ومعالج دقيق.
- استخدم مضخم القطب الكهربائي الدقيق في تكوين المشبك الحالي لتسجيل النشاط التلقائي في إمكانات المجال المحلي بعد استخدام وظيفة توازن الجسر في برنامج الاستحواذ لتصحيح المقاومة المتسلسلة للماصة. ستظهر تموجات الموجة الحادة التلقائية (SWRs) على شكل انحرافات إيجابية في الإمكانات خارج الخلية لطبقة SP (الشكل 3).
- لتسجيل إمكانات المجال المستحثة، استخدم المحفزات المتصلة بجهاز التحويل الرقمي لتوصيل نبضة جهد مربع قصيرة (200 منا) من خلال ماصة التحفيز المملوءة بكلوريد الصوديوم. اضبط قرص جهد التحفيز لاستحضار مجموعة من سعات الاستجابة.
