تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. إعداد التسجيل الفيزيولوجي الكهربي
- قم بتثبيت جلد الأذن الخارجية للفأر (الصيوان) على القاعدة المبطنة ب PDMS لغرفة التسجيل مع دبابيس حشرية دقيقة حول الحواف (~ 6-8 لكل أذن) ، ووضع الأعصاب التي تم تنظيفها في قاعدة الأذن بالقرب من قطبين كهربائيين للشفط - أحدهما للتسجيل (لأخذ العصب) والآخر قطب كهربائي غير مبال (لتوفير الإشارة المحايدة لمضخم تفاضلي).
- بالنسبة لقطب التسجيل، قم بمطابقة الفتحة والقطر الداخلي للفتحة بعناية مع السماكة المجمعة للعصبين، بحيث تتناسب بشكل مريح قدر الإمكان وبطول أكبر قدر ممكن.
- اسحب الأعصاب إلى القطب الكهربائي عن طريق الشفط اللطيف من حقنة سعة 2 مل متصلة بالطرف الآخر بأنابيب مطاطية من السيليكون. تأكد من أن الأعصاب مستقيمة وليست مطوية أو مضاعفة.
- قم بتطوير مقاومة كهربائية عالية / مقاومة مناسبة باستخدام شفط أقوى لسحب النسيج الضام أو الأنسجة الدهنية لتشكيل سدادة تغلق الفتحة حول العصب.
- املأ القطب الآخر (غير المبال) بالمحلول الملحي عن طريق الشفط إذا لزم الأمر (يمكن ملؤه بعمل الشعيرات الدموية).
- ضع أسلاك تسجيل متطابقة (فضية أو بلاتينية) في التجويف الداخلي لأقطاب التسجيل للاتصال بالمحلول الملحي والعصب (التسجيل) أو الطرف الضيق المصقول بالنار (غير مبال) بالقطب. يتم لحام كل قطب كهربائي بشكل فردي إلى نوى مختلفة من الكابلات ثنائية النواة. ضع قطب الحمام (الأرضي) (حبيبات Ag / AgCl) في الحمام وطحنه على شاشة الكبل ثنائي النواة المتصل بأقطاب التسجيل.
- قم بتغذية النشاط الكهربائي من القطبين في القنوات المنفصلة لمضخم تفاضلي ، ومرشح (تمرير النطاق 0.2-2 كيلو هرتز) ، وعرضه على شاشة راسم الذبذبات. تحقق من أن مستويات الضوضاء الكهربائية للقناة A (التسجيل) والقناة B (غير المبالية) تبدو متشابهة. في هذه المرحلة ، قد لا يكون من الممكن رؤية إمكانات الفعل التلقائي الطبيعية في القناة A قبل موازنة القطبين.
- قم بمعالجة أي اختلافات في ضوضاء الخلفية بين الأقطاب الكهربائية عن طريق زيادة مقاومة أقطاب التسجيل (القناة A) أو الأقطاب الكهربائية غير المبالية (القناة B). افعل ذلك عن طريق امتصاص النسيج الضام الهالة (الدهنية) في أي من القطب الكهربائي و / أو تطبيق قوة شفط أكبر على المحقنة سعة 50 مل.
- بمجرد "التوازن" بهذه الطريقة ، ارجع إلى التسجيل التفاضلي (AB) وابحث عن إمكانات الفعل التلقائي (APs) في التتبع أو عند تمسيد الشعر على هامش الصيوان. إذا لم يلاحظ أي نشاط (ارتفاع) ، فأعد التحقق من الملاءمة الضيقة للعصب في قطب التسجيل والنسيج الضام الهالة في القطب الطائفي - عادة ، كلما كان الختم أكثر إحكاما (مقاومة أعلى) وكلما كانت المقاومة أكثر مساواة في القطبين ، كان ذلك أفضل. مع الممارسة ، سيحقق هذا نسبة إشارة عالية الجودة (>2: 1).
- سجل مخطط كهربية الأعصاب عبر واجهة المختبر وبرنامج الفيزيولوجيا الكهربية الذي يعمل على جهاز كمبيوتر. يعد إخراج الصوت للارتفاع مفيدا جدا ويمكن تحقيقه عن طريق تغذية مخطط الأعصاب من خلال مضخم الصوت ومكبر الصوت المرتبط به. اضبط العتبة لتكون أعلى مباشرة من ضوضاء الخط الأساسي (التي يتم تحديدها من خلال عدم وجود "هسهسة" للضوضاء البيضاء).
- لزيادة وصول صبغة الستايريل الفلورية أو الدوائية إلى النهايات الرمحية ، قم بتقشير الطبقة الدهنية تحت الجلد بعناية بالقرب من هامش الصيوان ، وفتح نافذة ~ 5 مم × 5 مم ، وتعريض الأدمة وقاعدة البصيلات (الشكل 1 أ ، ب).
قم - بتثبيت طية من ~ 1 مم من جلد الأذن النظيف بالدهون عند الهامش الأمامي (على مستوى النافذة التي تم إنتاجها للتو ، إن أمكن) ، مع ترك فجوة واضحة مملوءة بالمحلول الملحي بين طبقات الجلد المحددة. قم بتمرير الشعيرات البارزة برفق على طول الحافة المطوية باستخدام دبوس أو ملقط دقيق مؤرض ، دون لمس الجلد ، لتحديد منطقة إخراج نقطة الوصول القصوى على راسم الذبذبات و "النقرات" و "الملوثات العضوية الثابتة" المميزة في إخراج الصوت.
2. تسجيل إمكانات العمل التي تثيرها التحفيز
- ضع مسبار التحفيز الميكانيكي - زجاج قطب كهربائي دقيق من البورسليكات مصقول بالنار مقاس 10 سم متصل بمشغل كهرباء ضغطية من السيراميك - بحيث تكون الحركة موازية لثنية الجلد. ضع الطرف على بعد حوالي 0.5-1 مم من ثنية الجلد ، بحيث يلامس الشعر ولكن ليس الجلد. تحقق من التحفيز الفعال عن طريق تحريك طرف المسبار يدويا ببطء لتشتيت الشعر ومراقبة / الاستماع إلى الارتفاع.
- استخدم البرنامج لدفع التحفيز الميكانيكي ل 1-3 شعيرات (على سبيل المثال ، 3 ثوان عند 5 هرتز من الجيوب الأنفية ، كل 10 ثوان ، إزاحة المسبار 200-500 ميكرومتر) ، وسجل الاستجابات التي يثيرها التحفيز في الأعصاب.
- أعط عدة قطارات تحفيز ميكانيكي متطابقة على فترات 10 ثوان. قم بتحسين موضع المسبار للتكرار ، ثم تقليل وتيرة التحفيز وفقا للبروتوكول التجريبي (على سبيل المثال ، معدل تكرار السقوط من 10 ثوان إلى 30 ثانية).
- استخدم البرنامج للتمييز بين النشاط الشبيه بنقطة الوصول ، على سبيل المثال ، باستخدام عتبة بسيطة تم تعيينها على ~ 2x سعة الضوضاء عالية التردد و ~ 25٪ من أكبر نقاط الوصول.
- احسب نقاط الوصول التي تعبر العتبة على أنها "أحداث" ، مع تحديد تردد وخصائص نقاط الوصول المنتجة.
< p class = "jove_title" >
3. تسجيل إطلاق النار المستحث بالتحفيز جنبا إلى جنب مع N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) Pyrridinium Dibromide
- لفحص تأثيرات أصباغ الستايريل على إطلاق النار الوارد المستحث بالتحفيز ووضع العلامات الطرفية ، أضف التركيز المناسب لصبغة الستايريل المفضلة إلى محلول الاستحمام واستمر في التسجيل الكهربائي.
- بعد وقت التعرض المطلوب (عادة 30 دقيقة على الأقل) ، قم بإعداد التحضير لعرض البصيلات. افتح سديلة الجلد عن طريق إزالة دبابيس التثبيت ، وقم بتعريض المنطقة الجلدية التي تم تطهيرها للكشف عن الملصقات الطرفية.
- اغسل الصبغة الخارجية بمحلول ملحي خال من الصبغة ، مما يؤدي إلى إجراء 3 تغييرات كاملة من المحلول الملحي.
- احتضان التغيير النهائي للمحلول الملحي الخالي من الصبغة الغازية لمدة 10-15 دقيقة للسماح لتلوث الصبغة الأكثر ثباتا بالتسرب من الأغشية المكشوفة / الخارجية.
- قم بإزالة الصبغة غير الداخلية المتبقية على الأغشية بعامل عزل (سلفوبوتيل بيتا سيكلودكسترين ، 1 ملي مولار ، 5 دقائق) في محلول ملحي.
- انقل غرفة التسجيل إلى مرحلة مجهر التألق المستقيم وقم بإشراك الغرفة بآلية حركة المسرح / الشريحة.
- قم بإضاءة المستحضر بضوء الإثارة المناسب لصبغة الستايريل. استخدم هدف المجهر الفلوري 10X أو 25X لمراقبة وضع العلامات على البصيلات (الشكل 1).
