$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. تشريح وتحضير اليرقات ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي
ملاحظة: يتم توضيح طرق تشريح اليرقات للجهاز العصبي المركزي بوضوح في Hafer و Schedl ، لكن هذه الطرق المنشورة سابقا تقلل من طول الخلايا العصبية الهابطة المهمة لقياس تردد الارتفاع. هنا ، يتم تحديد طريقة إضافية لاستئصال الجهاز العصبي المركزي اليرقي الذي يحافظ على الخلايا العصبية الهابطة الطويلة والسليمة.
- تحضير المحلول الملحي.
- تحضير التشريح وتسجيل المحلول الملحي إلى ما يلي في مللي مولار: 157 كلوريد الصوديوم ، 3 كيلو كلوريد ، 2 كلوريدالكالسيوم 2 ، 4 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-يل] حمض الإيثانسلفونيك (HEPES) ؛ معايرة الرقم الهيدروجيني إلى 7.25.
- تشريح اليرقات ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي.
- حدد واستخرج ذبابة الفاكهة السوداء المتجولة من الطور الثالث من قارورة الاستزراع وضعها في 200 ميكرولتر من المحلول الملحي (الشكل 1 أ).
- أمسك خطافات الفم بزوج من الملقط الناعم وامسك بطن اليرقة بزوج ثان من الملقط (الشكل 1 ب).
ملاحظه: لا تضغط كثيرا على البطن لأن ذلك قد يؤدي إلى تمزق الطبقة الجلدية الرقيقة لليرقة.
- اسحب خطافات الفم والبطن برفق في اتجاهات مختلفة لفصل الطرف الذيلي لليرقة عن منطقة الرأس وفضح أحشاء اليرقات (الشكل 1C).
ملاحظه: سوف يتشابك الجهاز العصبي المركزي مع القصبة الهوائية والجهاز الهضمي. لا تقطع الجهاز العصبي المركزي بعيدا عن أي نسيج لمنع قطع الأعصاب الطرفية الهابطة.
- ندف الجهاز العصبي المركزي خارج الجهاز الهضمي والقصبة الهوائية بالملقط (الشكل 1 د).
- إذا لزم الأمر ، قم بتعطيل الحاجز الدموي الدماغي عن طريق تمرير الجهاز العصبي المركزي الخلفي يدويا إلى الفصوص الدماغية باستخدام مقص زنبركي Vannas.
ملاحظه: يجب أن يتم ذلك بناء على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمادة الكيميائية المستخدمة. الخط الأحمر في الشكل 2 أ هو نقطة القطع المقترحة والجهاز العصبي المركزي المتقاطع مع جذوع الأعصاب الطرفية الهابطة السليمة الموضحة في الشكل 2 ب. الجهاز العصبي المركزي المتقاطع جاهز للتجريب بعد الانتهاء من الخطوة 1.2.5.
فئة
2. التسجيل خارج الخلية ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي.
- قم بإعداد الجهاز العصبي المركزي للتسجيل.
- اسحب قطب كهربائي من ماصة زجاجية من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات إلى مقاومة 5-15 ملي أوم.
- أدخل الجهاز العصبي المركزي المتقاطع في حجرة الشمع التي تحتوي على 200 ميكرولتر من المحلول الملحي. قم بتثبيت دبوس حشرة غير مطلي بمشبك التمساح ملحوم بالسلك الأرضي وأدخل الدبوس في المحلول الملحي لإكمال الدائرة.
- باستخدام المتلاعبات الدقيقة ، قم بتوجيه القطب الكهربائي إلى الطرف الذيلي للجهاز العصبي المركزي المنقول. تخلص من تسجيل ضوضاء الخلفية عن طريق ضبط مستوى العتبة في برنامج الاستحواذ / التحليل قبل الاتصال بجذوع الأعصاب الطرفية.
- ارسم أي أعصاب طرفية مريحة في قطب الشفط عن طريق تطبيق ضغط سلبي طفيف على المحقنة.
ملاحظه: يرتبط تردد إطلاق خط الأساس بعدد الخلايا العصبية المسحوبة إلى القطب الكهربائي حيث يؤدي المزيد من الخلايا العصبية في كثير من الأحيان إلى زيادة مقاومة القطب.
- ابدأ التسجيل خارج الخلية لنشاط الأعصاب التنازلي للجهاز العصبي المركزي.
- ابدأ التسجيل على برنامج الحصول على البيانات وراقب تردد إطلاق الخط الأساسي. اسمح لمعدل إطلاق النار بالتوازن لمدة 5 دقائق قبل جمع بيانات معدل إطلاق النار الأساسي.
- تجاهل التحضير والتسجيل إذا لم يكن نمط إطلاق معالجة التحكم نمطا مشابها لتلك الموضحة في الشكل 3A.
ملاحظه: يشير نمط إطلاق النار المتغير إلى نشاط غير طبيعي أو غير مستقر لمولد النمط المركزي ، والذي يمكن أن يغير الوظيفة العصبية.
- بعد 5 دقائق ، أضف 200 ميكرولتر من المحلول الملحي + السيارة لرفع الحجم الإجمالي للغرفة إلى 400 ميكرولتر لبدء تسجيل معدلات إطلاق التحكم.
- بعد إنشاء خط الأساس (3-5 دقائق) ، اسحب 200 ميكرولتر من المحلول الملحي وأضف 200 ميكرولتر من العامل التجريبي المذاب في محلول ملحي.
ملاحظه: ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) هو المذيب الموصى به للمركبات المحبة للدهون ويجب ألا يتجاوز 0.1٪ من الحجم.
- تطبيق تركيزات الدواء بطريقة تسلسلية (تركيزات منخفضة إلى عالية) وتسجيل كل تركيز لفترة زمنية محددة (يحددها الباحث بناء على الخصائص الكيميائية للدواء). قم بتسمية هذه النقطة الزمنية لتطبيق الدواء في برنامج الاستحواذ / التحليل من خلال تضمين تعليق يتضمن الدواء والتركيز النهائي.
ملاحظه: سينخفض نشاط إطلاق الجهاز العصبي المركزي بنسبة 10-20٪ تقريبا بعد 30-50 دقيقة بعد التشريح ، وبالتالي ، يجب إجراء الضوابط المناسبة غير المعالجة ، ويجب ألا تتجاوز العلاجات الدوائية هذه الفترة الزمنية.
