مراقبة النشاط الكهربائي العصبي الناجم عن النوبات في شرائح الدماغ باستخدام مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Panuccio ، G. ، et al. تسجيل وتعديل نشاط الصرع في شرائح دماغ القوارض إلى جانب مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. J. Vis. Exp. (2018)

يتضمن هذا البروتوكول استخدام مصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة (MEA) لتسجيل النشاط الكهربائي في شريحة دماغية معرضة لدواء مسبب للنوبات. يتضمن الإجراء وضع شريحة الدماغ في غرفة تسجيل MEA ، وتطبيق التحفيز الكهربائي للحث على نوبات اصطناعية ، وتحليل الإشارات الناتجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. إعداد إعداد MEA

ملاحظة: ابدأ قبل 15 دقيقة من التسجيل.

1. انقل الحجم المتبقي من 4AP-ACSF (4-أمينوبيريدين السائل النخاعي الاصطناعي) إلى قارورة إرلينماير سعة 500 مل.
2. ضع قارورة Erlenmeyer على رف فوق مضخم MEA (مصفوفات الأقطاب الكهربائية) واستخدم الأنابيب للسماح للمحلول بتغذية حقنة سعة 60 مل باستمرار. اضبط ارتفاع قارورة Erlenmeyer والحقنة للسماح بمعدل تغذية بالجاذبية يبلغ 1 مل / دقيقة
   ملاحظه: يعتمد الارتفاع الصحيح على القطر الداخلي للأنبوب (ID). بالنسبة للأنابيب التي يبلغ حجمها 5/32 بوصة ، يكفي 30 سم.
3. ابدأ في غلي 4AP-ACSF في قارورة Erlenmeyer وفي المحقنة بخليط غاز 95٪ O₂/5٪ CO₂.
4. دع 4AP-ACSF يتدفق عبر أنبوب التروية إلى دورق حتى لا يكون هناك هواء بالداخل ؛ ثم أوقف تدفق المحلول.
5. قم بتوصيل عنصر التسخين في قاعدة MEA بمنظم الحرارة. ضع شريحة MEA الجافة داخل مضخم الصوت MEA وقم بتأمين رأس مكبر الصوت. تنقل ماصة باستور البلاستيكية 4AP-ACSF إلى مدخل غرفة التسجيل والخزان الخارجي.
6. قم بتثبيت قنية التسخين بحامل مغناطيسي وضع طرفها داخل منفذ مدخل غرفة التسجيل. قم بتوصيل الحامل المغناطيسي بشريط مغناطيسي على رأس مضخم الصوت MEA. قم بتوصيل أنبوب التروية بالقنية. قم بتوصيل القنية بمنظم الحرارة.
   ملاحظه: يجب تغطية قنية التسخين بأنابيب بولي تترافلورو إيثيلين مشطوفة (PTFE) للوصول إلى منفذ مدخل غرفة التسجيل وتقليل الضوضاء بسبب مادتها المعدنية. عندما يكون خزان المدخل مملوءا بشكل كاف ب 4AP-ACSF ، يجب ألا تكون القطرات المتساقطة من نظام التروية مرئية.
7. ضع إبرة الشفط داخل الخزان وتحقق من وجود ضغط سلبي عن طريق غمرها في ACSF ؛ تحقق من وجود ضوضاء شفط ثابتة منخفضة التردد.
   ملاحظه: يجب وضع إبرة الشفط بحيث يتدفق 4AP-ACSF فوق سطح شريحة الدماغ مباشرة. يمكن استخدام خط تفريغ أو مضخة تفريغ منخفضة الضوضاء.
8. اضبط منظم التدفق للسماح بمعدل تدفق يبلغ 1 مل / دقيقة وابدأ في التهريد.
   ملاحظه: يزيل التروية التي تغذيها الجاذبية الضوضاء التي قد تسببها المضخات التمعجية. إذا كانت المضخات التمعجية مفضلة ، فإن النماذج منخفضة الضوضاء إلزامية.
9. بمجرد تدفق 4AP-ACSF عبر القنية ، قم بتشغيل منظم الحرارة. اضبط قنية التسخين على 37 درجة مئوية وقاعدة MEA على 32 درجة مئوية لتحقيق درجة حرارة 32 - 34 درجة مئوية داخل غرفة التسجيل.
   ملاحظة: الحذر! لا تقم أبدا بتسخين القنية بدون محلول فيها وإلا فقد تتلف بشكل لا رجعة فيه. اضبط درجة حرارة القنية أعلى من درجة حرارة التسجيل (أي 32 - 34 درجة مئوية) لحساب إزاحة درجة الحرارة الجوهرية بين القيمة المحددة والقيمة الفعلية عند طرف قنية التسخين وداخل غرفة التسجيل. يؤثر معدل التدفق ودرجة حرارة البيئة وحجم غرفة التسجيل على درجة حرارة محلول التسجيل. تم تحسين الإعدادات التي تم الإبلاغ عنها في الخطوة 1.9 للبروتوكول والمعدات الموصوفة. تحقق دائما من درجة حرارة التسجيل الفعلية باستخدام مزدوجة حرارية واضبط الإعدادات حسب الحاجة. لا تسخن قاعدة MEA فوق 34 درجة مئوية لتجنب ارتفاع درجة حرارة شريحة الدماغ.
10. ضع القطب المرجعي الخارجي في خزان مدخل غرفة التسجيل.
    ملاحظه: على الرغم من أن رقائق MEA مجهزة بقطب مرجعي داخلي ، إلا أن غرفة التسجيل المخصصة تغطي ذلك. وبالتالي ، يجب استخدام قطب مرجعي خارجي. تعتبر حبيبات KCl المشبعة (كلوريد البوتاسيوم) هي الأكثر عملية لأنها جاهزة للاستخدام دون الحاجة إلى الكلور.

2. رسم الخرائط الحية لمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا

1. بمجرد استقرار مستوى 4AP-ACSF ودرجة حرارة التسجيل حسب الرغبة ، قم بتحويل التروية ومحبس الشفط إلى وضع إيقاف التشغيل لإيقافهما مؤقتا.
   1. انقل شريحة دماغ واحدة بسرعة إلى غرفة تسجيل MEA باستخدام ماصة باستور زجاجية مقلوبة. اضبط موضعها على منطقة التسجيل في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا حسب الحاجة باستخدام ماصة باستور مجعدة مصقولة بالنار (الشكل 1C) أو فرشاة ناعمة ومضغوطة. ضع مرساة التثبيت (الشكل 1 د) على شريحة الدماغ. أعد تشغيل التروية والشفط عن طريق إعادة محبس محبس إلى وضع التشغيل.
      ملاحظة: حرج! يجب نقل الشريحة ، وإعادة تشغيل التروية في غضون 60 ثانية ، وإلا فقد يموت الأنسجة. يجب الاحتفاظ بمرساة الشريحة في 4AP-ACSF لمنع شريحة الدماغ من التحرك أثناء وضع المرساة على شريحة الدماغ بسبب الاختلافات في التوتر السطحي. يمكن تصنيع المرساة لتأمين شريحة الدماغ على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا حسب الطلب باستخدام أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ وخيط النايلون (الشكل 1 د) أو الحصول عليها من مصادر تجارية. يوضح الشكل 1E الإعداد التجريبي النهائي مع شريحة MEA المتصلة برأس مكبر الصوت: يتم تثبيت شريحة دماغية ترتكز على شريحة MEA داخل غرفة التسجيل بواسطة المرساة المخصصة. يتم وضع القطب المرجعي (الدائرة الحمراء) وأنبوب PTFE الذي يغطي قنية التسخين (السهم الأحمر) في خزان المدخل ، بينما يتم وضع إبرة الشفط (السهم الأزرق) في خزان المخرج.
2. التقط صورة لشريحة الدماغ باستخدام كاميرا مثبتة على مسرح مجهر مقلوب.
3. قم بتشغيل البرنامج النصي mapMEA على برنامج الكمبيوتر لبدء واجهة المستخدم الرسومية لتعيين الأقطاب الكهربائية.
   ملاحظه: يسمح البرنامج المخصص للمستخدم بتحديد الأقطاب الكهربائية التي تتوافق مع هياكل معينة لشريحة الدماغ. هذه الخطوة ضرورية لتنشيط المسار الصحيح وقمع نشاط ictal باستخدام التحفيز الكهربائي.
4. انقر على تصفح زر لتحميل صورة شريحة الدماغ. تأكد من ظهور القطب المرجعي في الصف العلوي من الجانب النصف الأيسر من MEA (الشكل 2 أ ، علامة المثلث). انقر على زر تنشيط المؤشر، ثم حدد الأقطاب العلوية والسفلية في الصف الموجود في أقصى يسار المصفوفة لتمييز إحداثيات XY لاستقامة الصورة وتعيين القطب الكهربائي.
5. من القائمة المنسدلة نوع الشريحة، حدد أفقي. ضع علامة في خانة الاختيار الهياكل الافتراضية.
   ملاحظه: من الممكن تخصيص الهياكل عن طريق تحديد الزر إدخال هياكل جديدة. يتم تصوير الهياكل الافتراضية لشريحة الدماغ الأفقية في الشكل 2 أ.
6. باستخدام الأزرار الانضغاطية المرقمة أسفل صورة شريحة الدماغ ، حدد الأقطاب الكهربائية المقابلة لعائد الاستثمار وانقر فوق الزر الانضغاطي المقابل في لوحة الهياكل لتعيينها (الشكل 2 ب) ؛ كرر هذه الخطوة لكل عائد استثمار.
7. اضغط على الزر "حفظ": يقوم البرنامج بإنشاء مجلد نتائج باسم #EXP_LabelledElectrodes يحتوي على جدول يبلغ عن الأقطاب الكهربائية المحددة وعائد الاستثمار.

< p class = "jove_title" >3. التسجيل والتعديل الكهربائي لنشاط الصرع

1. اسمح لشريحة الدماغ بالاستقرار داخل غرفة التسجيل لمدة 5 - 10 دقائق قبل التسجيل.
2. قم بتشغيل وحدة التحفيز قبل 10 دقائق على الأقل من بروتوكول التحفيز للسماح بالمعايرة الذاتية والثبات. ابدأ تشغيل برنامج التحكم في التحفيز وتحقق من توصيل المحفز ومضخم MEA بشكل صحيح ، كما هو موضح بمؤشر LED أخضر في اللوحة الرئيسية لبرنامج التحكم في التحفيز.
3. قم بإعداد التحفيز في تكوين ثنائي القطب. حدد أزواج الأقطاب الكهربائية الملامسة لطبقة الخلية الهرمية ل CA1 / subiculum القريب (راجع 24،25) من بين تلك التي تم تعيينها باستخدام البرنامج النصي mapMEA (راجع القسم 12). استخدم سلكا لتوصيل أحد الأقطاب الكهربائية المحددة بالقابس السالب للمحفز والقطب الآخر بالقابس الموجب لنفس قناة المحفز. استخدم سلكا آخر لتوصيل أرض المحفز بأرض مكبر الصوت.
4. ابدأ تشغيل برنامج التسجيل. للحصول على البيانات ، اضغط على زر PLAY في اللوحة الرئيسية لبرنامج التسجيل. سجل ما لا يقل عن 4 إفرازات ictal.
   ملاحظه: يسمح تردد أخذ العينات البالغ 2 كيلو هرتز باكتساب إمكانات ميدانية بدقة عادلة مع تقليل استخدام مساحة القرص الصلب. يستغرق ملف التسجيل الذي تبلغ مدته 5 دقائق ~ 80 ميجابايت. قد تكون هناك حاجة إلى ترددات أخذ عينات أعلى ، على سبيل المثال ، لتسجيل القطع الأثرية التحفيزية أو النشاط متعدد الوحدات. لمراقبة إمكانات المجال فقط ، استخدم مرشح تمرير منخفض مباشر عند 300 هرتز لقطع النشاط متعدد الوحدات.
5. تحديد شدة التحفيز.
   1. في برنامج التحكم في التحفيز ، استخدم اللوحة الرئيسية لتصميم نبضة تيار موجبة سالبة مربعة ثنائية الطور تبلغ 100 ميكرو ثانية / مرحلة.
      ملاحظة: الحذر! يتطلب تحفيز التيار المباشر نبضة شحن متوازنة لتجنب إتلاف المعدات.
   2. قم بإجراء اختبار إدخال / إخراج سريع (I / O) لتحديد أفضل شدة تحفيز. قم بتسليم نبضة التحفيز المصممة في الخطوة 3.5.1 عند 0.2 هرتز أو أقل عن طريق إضافة فاصل زمني بين النبضات يبلغ 5 ثوان أو أكثر في الشكل المناسب لبرنامج التحكم في التحفيز. في علامة تبويب سعة النبض ، أدخل سعة نبضة أولية تبلغ 100 ميكرو أمبير / طور وقم بزيادة 50 - 100 μA خطوات في كل تجربة حتى يمكن للتحفيز أن يستحضر بشكل موثوق أحداثا شبيهة بالخلايا البينية في القشرة المجاورة للحصين (تحقق من الإشارات التي يتصورها برنامج التسجيل).
6. التعديل الكهربائي لتكوين الحوفي
7. قم ببرمجة وحدة التحفيز لتقديم بروتوكول التحفيز محل الاهتمام. استخدم سعة التحفيز المحددة أثناء اختبار الإدخال / الإخراج.
   ملاحظه: يجب أن يكون معدل فشل الاستجابات المستحثة ≤20٪.
8. بعد توقف التحفيز ، تحقق من استرداد الشبكة إلى حالة ما قبل التحفيز عن طريق تسجيل ما لا يقل عن 4 تصريفات ictal (كما في الخطوة 3.4).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: المعدات المخصصة المستخدمة لهذا البروتوكول. (أ) يتم تجميع غرف الاحتجاز للتعافي والتسخين المسبق والحضانة المسبقة في 4AP باستخدام دورق وطبق بتري. يجب أن يكون قطر طبق بتري أصغر من القاطع ويتم تثبيته في مكانه عن طريق مكبس حقنة. يتم استبدال الجزء السفلي من طبق بتري بشبكة من النايلون (من الجوارب الناعمة) ملتصقة بالسيانواكريلات على حافة طبق بتري. يتم توفير الأكسجين عن طري...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بولي د-يسين سيجما أدريتش P7886 مطلوب لطلاء MEA كلوريد الصوديوم سيجما أدريتش S9888 كيميائي كيه سي إل سيجما أدريتش ص 9541 كيميائي كيه 2 ب 4 سيجما أدريتش 795488 كيميائي CaCl2 * 2 H2O سيجما أدريتش سي 3306 كيميائي د-جلوكوز سيجما أدريتش RDD016 كيميائي NaHCO3 سيجما أدريتش الطراز S5761 كيميائي MgCl2 * 6 H2O سيجما أدريتش M2670 كيميائي MgSO4 * 6 H2O سيجما أدريتش م 5921 كيميائي سكروز سيجما أدريتش RDD023 كيميائي حمض البيروفيك ، 98٪ سيجما أدريتش هاتف: 107360 كيميائي 4-أمينوبيريدين سيجما أدريتش أ78403 المخدرات المتشنج STG-2004 نظام متعدد القنوات STG4004-1.6 مللي أمبير مولد تحفيز 4 قنوات بجهد (±8 فولت) وخرج تيار (±1.6 مللي أمبير) MEA1060 نظام متعدد القنوات غير متاح مضخم MEA مستوي الشرق الأوسط وأفريقيا نظام متعدد القنوات 60MEA500 / 30iR-Ti ث / س الدائري يجب أن يكون بدون حلقة للسماح باستخدام غرفة التسجيل المخصصة ماكراك نظام متعدد القنوات برنامج التسجيل ماكستيمولوس الثاني نظام متعدد القنوات برنامج التحكم في STG4004 تي سي 02 نظام متعدد القنوات تي سي 02 ترموستات 2 قناة PH01 نظام متعدد القنوات PH01 تسخين التروية القناة ميلا في الساعة نظام متعدد القنوات ميلا في الساعة حامل مغناطيسي ل PH01 وإبرة شفط الإيلاستوستيل E43 واكر ه 43 مانع التسرب المرن المستخدم لتركيب غرفة التسجيل المخصصة على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا غرفة مخصصة في الشرق الأوسط وأفريقيا أداة كريسيل غرفة SKE الشرق الأوسط وإفريقيا غرفة تسجيل مخصصة قطب Ag / AgCl ، بيليه ، 1.0 مم أداة كريسيل 64-1309 قطب مرجعي لغرفة التسجيل المخصصة تيغازيم سيجما أدريتش Z273287-1EA منظف إنزيمي متلاب الرياضيات بيئة البرمجة لإزالة الخرائط الكهربائية VT1000S لايكا بيوأنظمة VT1000S الاهتزاز وارنر إنسترومنتس 64-1309 حبيبات القطب الكهربائي Ag-AgCl 1.0 مم (E205). القطب المرجعي.