السلوك الملاحي ليرقات ذبابة الفاكهة استجابة للتحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية الحسية الشمية

الملخص

المصدر: Clark، D. A.، et al. تتبع سلوك ذبابة الفاكهة استجابة للتحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية الشمية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو دراسة للسلوك الملاحي ليرقات ذبابة الفاكهة استجابة للتحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية الحسية الشمية (ORNs). ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا توضع اليرقات التي تعبر عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء في ORNs على الاغاروز داخل ساحة السلوك. يفتح التحفيز البصري الوراثي بالضوء القنوات ، مما يتسبب في تدفق الكاتيون الذي يؤدي إلى نقل الإشارة إلى الدماغ ، ويتم تسجيل سلوك الملاحة.

البروتوكول

1. بناء ساحة سلوكية وإعداد الأجهزة لتمكين التحفيز البصري الوراثي في ساحة السلوك

1. لبناء ساحة سلوك محرومة من الضوء ، قم ببناء صندوق بأبعاد 89 × 61 × 66 سم³ (35 بوصة طول × 24 بوصة عرض × 26 بوصة ارتفاع) مصنوع من صفائح أكريليك زجاجية سوداء اللون (بسمك 3 مم) (انظر جدول المواد). يجب أن تكون المواد اللازمة لبناء مثل هذا الصندوق متاحة في متاجر الأجهزة المحلية. ضع هذا الصندوق على سطح طاولة في غرفة السلوك (الشكل 1 أ).
2. قم بتركيب كاميرا ناقل تسلسلي عالمي أحادي اللون (USB) 3.0 مزودة بمرشح 830 نانومتر طويل التمرير بالأشعة تحت الحمراء (IR) وعدسة 8 مم F1.4 C-mount (انظر جدول المواد) في وسط سقف الصندوق الأسود. ضع شريطين من الصمام الثنائي الباعث للضوء بالأشعة تحت الحمراء (LED) (انظر جدول المواد) على سطح الطاولة لإضاءة اليرقات في الساحة المظلمة (الشكل 1 أ).
3. لبناء منصة LED ، احصل على لوح ألومنيوم مقاس 22 سم × 22 سم مربع (يفضل رذاذ مطلي بلمسة نهائية سوداء غير لامعة للتخلص من أي انعكاسات). في وسط اللوحة ، باستخدام قاطع معدني ، قم بقطع ثقب كبير بما يكفي ليناسب كاميرا CCD.
4. قم بتغطية اللوحة المعدنية بأضواء شريطية LED حمراء (انظر جدول المواد). لحام LED شريط الشريط في سلسلة وتغذية الأسلاك الشريطية في مرحل optocoupler يتم التحكم فيه بواسطة معالج دقيق Raspberry Pi 2B (انظر جدول المواد) (الشكل 1 ب و 2).
5. قم بتثبيت وتكوين نظام التشغيل المستند إلى Ubuntu Mate / Raspian Jesse / Linux على معالج Raspberry Pi قبل توصيل مرحل optocoupler بشرائط LED. قم بتوصيل مصدر طاقة لتشغيل شرائط LED ومقرنة البصر (الشكل 2) (انظر جدول المواد). قم بتركيب منصة LED حول كاميرا CCD (الشكل 1 ب).
   ملاحظه: نظام التشغيل Ubuntu Mate v16.04 متاح مجانا. يمكن تكييف مجموعة من الأوامر البسيطة المستندة إلى Python بسهولة مع أنماط برنامج محفزات ضوء LED (انظر ملف بناء الجملة).
6. ضمان إشعاع متجانس في نقاط مختلفة في ساحة السلوك. قم بقياس الإشعاع المطلق على سطح الساحة بمساعدة مقياس الطيف وحدده على أنه ~ 1.3 واط / م² في جميع أنحاء سطح الساحة.
   ملاحظه: عند هذه الشدة ، لم يلاحظ أي تغيرات كبيرة في درجة الحرارة على مدار التجارب. استخدمت دراسة أخرى إشعاعا أعلى يبلغ ~ 1.9 واط / م² ولم تلاحظ أي تغيرات في درجة الحرارة على مدار التجارب.

< p class = "jove_title" >2. تحضير يرقات ذبابة الفاكهة لتحليلات السلوك

1. حافظ على الذباب على طعام الذباب القياسي (انظر جدول المواد) عند 25 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية 50-60٪ (RH) ، ودورة إضاءة / ظلام 12 ساعة / 12 ساعة.
2. من أجل التعبير عن CsChrimson في زوج واحد من ORNs ، اعبر الإناث البكر من خط UAS-IVS-CsChrimson إلى الذكور من خط OrX-Gal4 (يتوافق "X" مع واحد من 21 جينا لمستقبلات رائحة اليرقات (Or) التي يتم التعبير عنها بشكل فريد في كل من 21 زوجا من ORNs).
   1. بالتناوب ، من أجل التعبير عن CsChrimson في جميع ORNs اليرقات البالغ عددها 21 ، اعبر الإناث البكر من خط UAS-IVS-CsChrimson إلى الذكور من خط Orco-Gal4 ("Orco" هو المستقبل المشترك الذي يتم التعبير عنه في جميع ORNs البالغ عددها 21).
   2. استخدم خط UAS-IVS-CsChrimson في حد ذاته كعنصر تحكم في هذه التجارب.
      ملاحظه: مخزون الذباب المدرج هنا كلها متوفرة في مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (انظر جدول المواد).
3. بمجرد السماح للذباب الذكور والإناث في الصليب بالتزاوج ووضع البيض لمدة 48 ساعة ، انقل البالغين إلى قارورة جديدة.
   1. إلى سطح قارورة الطعام التي تحتوي على البيض ، أضف 400 ميكرولتر من خليط يحتوي على 400 ميكرومتر من الشبكية المتحولة بالكامل (ATR) المذابة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 89 ملي مولار من السكروز المذاب في الماء المقطر><. ملاحظه: تعزز الكمية الصغيرة من السكروز تغذية اليرقات لمحلول ATR. ATR هو عامل مساعد مطلوب لتنظيم تعبير CsChrimson. ATR حساس للضوء.
   2. بمجرد إضافة ATR إلى قوارير الطعام التي تحتوي على البيض ، احتضن القوارير في الظلام لمدة 72 ساعة إضافية < br / > ملاحظة: في حين أن هذه الدراسة والدراستين المذكورتين أعلاه لم تلاحظ تأثيرات على سلوك اليرقات بسبب تغذية ATR ، فمن المستحسن التحكم في تأثيرات تغذية ATR عن طريق إخضاع خطوط الاختبار لنفس الكمية من الخليط أعلاه الذي لا يحتوي على ATR.
4. استخرج يرقات الطور الثالث (~ 120 ساعة بعد وضع البيض) من سطح طعام الذباب عن طريق تعويمها باستخدام محلول سكروز عالي الكثافة (15٪). باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، افصل اليرقات العائمة على سطح محلول السكروز إلى دورق زجاجي سعة 1000 مل.
5. اغسل اليرقات 3-4 مرات عن طريق استبدال 800 مل من الماء المقطر الطازج في الدورق الزجاجي في كل مرة. اسمح لليرقات بالراحة لمدة 10 دقائق قبل إخضاعها لفحص السلوك.

3. فحص السلوك

1. حافظ على درجة حرارة ثابتة (بين 22-25 درجة مئوية) ورطوبة (بين 50 و 60٪ رطوبة نسبية) في غرفة السلوك.
2. تحضير وسط زحف اليرقات عن طريق صب 150 مل من الاغاروز المذاب (1.5٪) في طبق بتري مربع مقاس 22 سم × 22 سم. يسكب طبق بتري واحد لكل تجربة من الفحص ، 8-10 تجارب لكل تجربة. اترك الاغاروز يتماسك ويبرد لمدة 1-2 ساعة في أطباق بتري قبل استخدامها في مقايسة السلوك.​
   1. لا تنقل أكثر من 20 من يرقات الطور الثالث المحضرة إلى وسط طبق بتري (الشكل 1 ج). غطي طبق بتري بغطاءه. ضع طبق بتري في ساحة السلوك أسفل كاميرا CCD.
      ملاحظه: اعتمادا على التجربة ، يتم إجراء فحوصات السلوك عادة لمدة 3-5 دقائق. إذا تم استخدام رائحة في الفحص لتوفير إشارات إرشادية ، فقد لوحظ أن تدرج الرائحة الناتج يظل مستقرا لمدة 5 دقائق تقريبا. لا ينصح بأوقات فحص أطول. لم تلاحظ آثار ضارة على اليرقات بسبب الجفاف أو من التعرض المطول للضوء الأحمر لمدة 630 نانومتر خلال هذه النقاط الزمنية.
3. قم بتشغيل مصدر ضوء LED بالأشعة تحت الحمراء 850 نانومتر لتصور اليرقات في الفيديو. ابدأ تشغيل كاميرا CCD لتسجيل حركة اليرقات.
4. باستخدام البرنامج المرتبط بمعالج Raspberry Pi ، قم ببرمجة الإجراء لإدارة الأنماط المناسبة لتحفيز الضوء الأحمر.
   ملاحظه: يمكن تكييف مجموعة من الأوامر البسيطة المستندة إلى Python بسهولة مع أنماط برنامج محفزات ضوء LED (انظر ملف بناء الجملة).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: ساحة السلوك ووسط زحف اليرقات. (أ) منظر أمامي لساحة سلوك الصندوق الأسود. يكشف الباب المفتوح للساحة عن كاميرا CCD معلقة من سقف الصندوق. (ب) يتم تثبيت منظر سفلي لمنصة معدنية تحتوي على شرائط إضاءة LED حمراء تستخدم للتحفيز البصري الوراثي حول كاميرا CCD. (ج) منظر علوي لوسط زحف اليرقات المستخدم في الفحص. قبل البدء في تسجيل حركة اليرقات ، يتم وضع ~ 20 يرق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كاميرا فيديو لالتقاط حركة اليرقات كاميرا CCD إدموند للبصريات 106215 M52 إلى M55 مرشح محول الموضوع إدموند للبصريات 59-446 2 "حامل مرشح ملولب مربع لعدسات التصوير إدموند للبصريات 59-445 RG-715 ، 2 بوصة مربعة مرشح Longpass إدموند للبصريات 46-066 إلكترونيات لإعداد البصريات الوراثية توت العليق باي 2 ب RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2 3 قناة امدادات الطاقة القابلة للبرمجة newegg.com 9SIA3C62037092 8 قناة optocoupler مرحل amazon.com 6454319 630nm أضواء شريطية LED رباعية الصفوف environmentallights.com أحمر3528-450-بكرة شرائط LED 850 نانومتر environmentallights.com الفسفور الابيض - 4000 كيت - CC5050 - 60x2 برمجيات أوبونتو MATE v16.04 نوبونتو https://github.com/yslo/nubuntu عناصر أخرى زجاج شبكي أكريليك أسود هوم ديبوت MC1184848bl يطير الطعام والكواشف الأخرى طعام ذبابة Nutrifly جينيسي العلمية 66-112 مسحوق الاغاروز جينيسي العلمية 20-102 22 سم × 22 سم مربع صحن بتري شركة VWR هاتف: 25382-327 DMSO سيجما ألدريتش د2650 سكروز سيجما ألدريتش 84097 جميع الشبكية عبر سيجما ألدريتش R2500 ذباب UAS-IVS-CsChrimson مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 55134 أوركو جال4 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة هاتف: 26818 Or42a-Gal4 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 9970 Or7a-Gal4 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة هاتف: 23907