$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تقييم دور البروتينات قبل المشبكية في الدوائر العصبية السليمة عن طريق التحفيز المستهدف للخلايا العصبية المتساقطة مع علم الوراثة البصرية
ملاحظة: يتطلب البروتوكول التالي خبرة سابقة في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في شرائح الدماغ الحادة والوصول إلى إعداد الفيزيولوجيا الكهربية.
- حقن الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة مع النمط المصلي الفسيفسائي 1 و 2 (rAAV1 / 2) في الدماغ. تحديد الإحداثيات التجسيمية لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام باستخدام الأطالس التجسيمية لدماغ الفأر أو الفئران.
- استخدم مجتذب ماصات دقيقة لسحب الماصات الدقيقة للحقن ذات السيقان الطويلة من Ø 7-9 ميكرومتر؛ قم بقص ماصات الحقن الدقيقة على السيقان بالمقص. استخدم علامة رفيعة وورق رسم بياني لوضع علامات المعايرة على ماصات الحقن الدقيقة كل 2 مم.
- تخدير بالأيزوفلوران وإصلاحه في الجهاز التجسيمي.
- حافظ على دفء طوال العملية باستخدام وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية.
- حماية العينين بمواد تشحيم العين.
- احلق الفراء على الرأس بشفرة حلاقة كهربائية.
- انشر بوفيدون اليود على الرأس المحلوق باستخدام برعم قطني.
- تحت مجهر تشريح ، قم بعمل شق خط الوسط.
- نظف سطح الجمجمة بقطعة قطن ، بحيث تكون البريجما واللامدا مرئية.
- ضع ماصة الحقن الدقيقة في حاملها. قم بتوصيل الحامل بالذراع التجسيمية.
- تحديد إحداثيات x و y لموقع الحقن بالنسبة إلى bregma و / أو lambda.
- استخدم مثقابا لتخفيف الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة.
ملاحظه: استخدم حركات دائرية لطيفة وتجنب الحفر في الجمجمة لأن ذلك سيتلف سطح الدماغ.
- إذا كان هناك نزيف ، امتصاص الدم الزائد بورق منشفة.
ملاحظه: سيجعل الدم الزائد من الصعب تحديد إحداثيات z بشكل صحيح.
- قم بتحميل ≤2 ميكرولتر من الفيروس في ماصة الحقن الدقيقة عن طريق العمل الشعري.
- أحضر ماصة الحقن الدقيقة إلى إحداثيات x وy لموقع الحقن.
- احسب إحداثيات z من الجافية وقم بخفض الماصة ببطء في الدماغ.
- عند الوصول إلى إحداثي z ، انتظر 3 دقائق للسماح بتعديل الأنسجة.
- استخدم ضغطا إيجابيا منخفضا باستخدام حقنة سعة 1 مل متصلة عبر أنبوب مرن بالجزء الخلفي من ماصة الحقن دقيقة. راقب بصريا سرعة إخراج الفيروس من ماصة الحقن الدقيقة من خلال مجهر التشريح واستخدام علامات المعايرة كنقاط مرجعية.
ملاحظه: يجب حقن الفيروس بمعدل بطيء (<100 نانولتر / دقيقة) لتجنب تلف الأنسجة.
- عند الانتهاء من الحقن ، انتظر 5 دقائق ، واسحب ماصة الحقن الدقيقة بمقدار 0.2 مم ، وانتظر لمدة 5 دقائق أخرى ، لتجنب ارتجاع الفيروس.
- اسحب ماصة الحقن الدقيقة ببطء وبشكل كامل من الدماغ وتخلص منها في وعاء مملوء بالمبيض.
- بلل الجمجمة بمحلول فسيولوجي وخياطة الجلد ب 3-4 غرز.
- ضع مرهم جنتاميسين على الجرح.
ضع - في قفص نظيف مع كريات الطعام وتحت مصباح حراري حتى يتعافى تماما.
- بعد ≥15 يوما من الحقن ، قم بقطع رأس تحت التخدير العميق من الأيزوفلوران.
- تحضير شرائح دماغية حادة من منطقة الدماغ ذات الأهمية باستخدام محلول السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المثلج (95٪ O2 ، 5٪CO 2) ، يحتوي على (بالمللي مولار): 123 كلوريد الصوديوم ، 1.25 كيلو كلوريد ، 1.25 كيلو هيلو أمبير2، 1.5 كلوريد الوزرعة2 ، 1 كلوريد المكالسيوم2 ، 25 هيدروكسيد الصوديوم3 ، 2 بيروفات الصوديوم و 18 جلوكوز (الأسمولية المعدلة إلى 300 مللي أسم). على سبيل المثال ، إذا كان الهدف هو تحليل الانتقال المشبكي من الخلايا العصبية الهرمية CA3 إلى CA1 ، فقم بإعداد شرائح سهمية لتكوين الحصين (بسمك 350 ميكرومتر).
ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، اعمل في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة لتجنب تنشيط المسبار البصري الوراثي بواسطة الضوء البيئي.
- دع الشرائح تتعافى لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نفس aCSF في غرفة مصممة لحمل شرائح الدماغ. احتفظ بالشرائح في نفس غرفة شريحة الدماغ في درجة حرارة الغرفة حتى التسجيل.
ملاحظه: باستخدام هذه الظروف ، يمكن الحفاظ على صحة الشرائح لمدة تصل إلى 6-8 ساعات.
- انقل شريحة واحدة إلى غرفة تسجيل مغمورة وقم بدمج 2 مل / دقيقة من نفس aCSF المستخدم للاسترداد مع 1.5 ملي مولار CaCl2 (إجمالي Ca2+: 2.5 mM) وبدون بيروفات الصوديوم.
ملاحظه: يتم تحضير الشرائح والحفاظ عليها بتركيز منخفض من Ca2+ (1 مللي مولار) لتقليل السمية. يتم إجراء التسجيلات في 2.5 ملي مولار Ca2+ لصالح إطلاق الحويصلة.
- تحقق بإيجاز من إشارة المراسل الفلوري المعبر عنه (على سبيل المثال. TdTomato. الشكل 1 ب) للتأكد من توطين وشدة العدوى.
- املأ قطبا كهربائيا بمحلول داخل الخلايا يحتوي على (بالمللي مولار): 110 كلين غلوكونات ، 22 كيلو كلوريد ، 5 كلوريد الصوديوم ، 0.5 إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ، N ′ ، N ′ - حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ، 3 MgCl2 ، 4 ملح مغنيسيوم ثلاثي الفوسفات الأدينوزين 5 ′ ثلاثي الفوسفات (Mg-ATP) ، 0.5 ملح جوانوزين 5'-ثلاثي الفوسفات ثلاثي الصوديوم (Na3-GTP) ، 20 ك2- فوسفات الكرياتين ، 10 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيإيثان سلفونيك عازل بحمض معدلة مع KOH (HEPES-KOH ، درجة الحموضة 7.28 ، 290 مللي أوم).
ملاحظه: استخدم قطب التصحيح بمقاومة ماصة تتراوح من 5 إلى 6 ملي أوم.
- تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، قم بالوصول إلى تكوين خلية كاملة محكمة الغلق من خلية عصبية تتلقى مدخلات متشابكة من الخلايا العصبية المصابة. على سبيل المثال ، إذا أصيبت الخلايا العصبية الهرمية CA3 ، فقم بتصحيح الخلايا العصبية الهرمية في السبيل الإنسي القريب من المنطقة CA1 (الشكل 1C).
ملاحظه: يمكن ترك مقاومة السلسلة دون تعويض ، ولكن يجب أن تكون ثابتة ومنخفضة (≤20 MΩ).
- استخدم علم الأدوية لعزل التيارات المشبكية قيد الفحص. على سبيل المثال ، إذا كان الهدف هو التحقيق في الإرسال المشبكي الاستثاري ، فقم بمنع الإرسال المشبكي المثبط مع 10 ميكرومتر.
- استحضار التيارات المشبكية ، على سبيل المثال ، التيارات المثيرة بعد المشبكي (EPSCs) ، باستخدام ليزر أزرق 473 نانومتر مقترنا بألياف ضوئية (Ø ≤250 ميكرومتر) موضوعة على سوماتا الخلايا العصبية المصابة (على سبيل المثال. الخلايا العصبية الهرمية CA3).
- اضبط طول التحفيز إلى الحد الأدنى ، لتقليل إمكانية استحضار أكثر من جهد فعل واحد لكل نبضة ضوئية. إذا كنت تستخدم ChETA ، فقم بتعيينه على 2 مللي ثانية.
- ضبط قوة التحفيز لليزر لإنتاج تيارات متشابكة صغيرة ولكن يمكن اكتشافها بوضوح (سعة ذروة ≤50 pA ل EPSCs المسجلة عند إمكانات الاحتفاظ -70 مللي فولت بين الخلايا العصبية الهرمية CA3 و CA1 ؛ الشكل 1 د). في حالة استخدام ChETA وألياف ضوئية بقطر 250 ميكرومتر ، يجب أن تكون قوة التحفيز من 1-3 ميجاوات عند خروج الألياف مناسبة.
ملاحظة: إذا تعذر تنظيم قوة الليزر ، فاستخدم مرشحات الكثافة المحايدة.
- قم بتضليل ضوء الليزر 473 نانومتر على سوماتا الخلايا العصبية المصابة ، ولكن ليس على محاورها. على سبيل المثال ، سلط الضوء على CA3 somata ، وبعيدا عن ضمانات Schaffer ، لتجنب إزالة الاستقطاب المباشر للمحاور.
- ضع السموم الرباعية (TTX ؛ 0.5 ميكرومتر) ، وهو مانع لقنوات الصوديوم ، على العينة للتأكد من أن القنوات مدفوعة بجهد العمل.
- في تسجيلات مختلفة ، قم بتطبيق مانع انتقائي على التيار المشبكي قيد التحقيق للتأكد من أن التحفيز انتقائي
ملاحظه: على سبيل المثال ، قم بتطبيق 2،3-dioxo-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo [f] quinoxaline (NBQX ، 10 ميكرومتر) على α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxolepropionic acid (AMPA) من نوع EPSCs بوساطة مستقبلات الغلوتامات.
- قارن بين التيارات المشبكية التي يتم استثارها بصريا وكهربائيا في نفس شريحة الدماغ الحادة استجابة للتحفيز المتكرر (≥2 محفزات عند ≤20 هرتز). يجب ملاحظة درجة مماثلة من التيسير المشبكي أو الاكتئاب بين التحفيز الكهربائي والبصري عند استخدام microRNA للتحكم (miR) ، مما يشير إلى أن الآليات الخلوية المتشابهة يتم تنشيطها بواسطة نوعي التحفيزات.
ملاحظه: الخطوات المذكورة أعلاه ضرورية للتأكد من أن التحفيز البصري لا يؤدي إلى إزالة الاستقطاب المباشر للعصوات قبل المشبكية ، وبالتالي تجاوز بعض آليات الانتقال المتشابك.
