قياس النشاط العصبي في شريحة دماغ الفأر بعد الحضانة لفترات طويلة

الملخص

المصدر: Cameron ، M. A. ، et al. ، حضانة طويلة للأنسجة العصبية الحادة للفيزيولوجيا الكهربية وتصوير الكالسيوم. J. Vis. Exp. (120) ، (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية لقياس النشاط العصبي في شرائح دماغ الفأر باستخدام تصوير الكالسيوم والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. من خلال حشو الأنسجة بأيونات البوتاسيوم وتسجيل تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا من خلال التصوير الرقمي عالي السرعة ، تكشف هذه الطريقة عن الاستجابات العصبية في الوقت الفعلي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

فئة < p = "jove_title" >1. تحميل صبغة الكالسيوم

1. حدد أصباغ الكالسيوم بناء على تفضيل الباحث الفردي. هنا نستخدم Fluo-8AM أو Fluo-4AM. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأصباغ الأخرى أيضا: قم بإذابة أصباغ الكالسيوم في DMSO إلى محلول 1 ملي مولار والبوليمرات المشتركة للكتلة بنسبة 1٪ (على سبيل المثال ، حمض البلورونيك -127) إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر والصوتنة لمدة 10 دقائق.
2. أضف محلول إلى aCSF إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر ، 0.01٪ كتلة البوليمرات المشتركة لشرائح الدماغ.
   1. بالنسبة للحيوانات البالغة ، (>12 أسبوعا) ، قم بتقطيع الأصباغ (50 ميكرولتر) مباشرة على شرائح الدماغ ، وحافظ عليها لمدة 75 دقيقة للسماح باختراق الصبغة بشكل أفضل في الطبقات العميقة.
   2. لضمان الأكسجين الكافي للشريحة المغمورة أثناء حضانة الصبغة ، قم بإعداد غرفة تحميل زجاجية بغطاء مغلق (وعاء دائري بقطر 2.5 سم ، ارتفاع 3.5 سم) مع أصباغ الكالسيوم المخففة في 2.5 مل من aCSF. أكسجين بشكل مستمر مع 95٪ O₂/5٪ CO₂. لا تفقاع.
3. بعد تحميل الصبغة ، اغسل الأنسجة باستخدام aCSF وانقلها إلى نظام الحضانة ، مع تقليل درجة الحرارة ببطء إلى 15-16 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام التجريبي.

2. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتصوير

1. ضع الأنسجة في غرفة تسجيل مغمورة تحت المجهر وقم بتسخينها باستخدام aCSF المؤكسج بمعدل تدفق 4-5 مل / دقيقة إما عند RT (~ 22 °C) أو درجة حرارة فسيولوجية (~ 35 °C). أمسك المنديل في مكانه باستخدام "قيثارة" مصنوعة خصيصا من خيوط النايلون أو الذهب الممتدة والملتصقة عبر قطعة من الذهب أو الأسلاك البلاتينية على شكل حرف U.
2. للفيزيولوجيا الكهربية:
   1. قم بإعداد ماصات التسجيل من زجاج البورسليكات 1.5 مم (1.19 مم ID) باستخدام مجتذب ماصة دقيقة لتحقيق مقاومة نهائية تتراوح من 5 إلى 6 MΩ.
   2. املأ الماصة بمحلول داخلي من 3 إلى 4 ميكرولتر وتصور الخلايا تحت تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) باستخدام كاميرا CCD. يجب تصميم الحل داخل الخلايا بعناية لكل تجربة لتحقيق نتائج تجريبية.
   3. ضع الماصة مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق من خلال منفذ الشفط على حامل الماصة على غشاء الخلية باستخدام معالج دقيق. لا يلزم كشط الغشاء المسبق منذ إزالة ILM من شبكية العين. بمجرد وضع الماصة على الخلية، قم بالضغط السلبي اللطيف على الماصة للحصول على إحكام تسرب جيجا أوم. ثم قم بتمزيق غشاء الخلية بكمية قصيرة من الضغط السلبي.
   4. قم بإجراء تسجيلات مشبك تيار أو جهد كامل الخلية باستخدام التقنيات القياسية حسب الاقتضاء.
3. تصوير الكالسيوم:
   1. للحصول على طول موجي واحد للإثارة ل Fluo-4 ، قم بتصفية ضوء الإثارة من خلال مرشح ممر نطاق 460-490 نانومتر والضوء المنبعث من خلال مرشح ممر نطاق 515-550 نانومتر. استخدم كاميرا رقمية عالية السرعة للحصول على التسجيل الأسرع والأكثر حساسية. الحصول على الصور كما هو مطلوب.
   2. قم بقياس التغيرات في التألق كدالة للوقت إما بطول موجي واحد (Fluo-4).

المواد