اختبار الوصلات أحادية المشبك باستخدام قنوات الصوديوم المقاومة للرباعي والسموم الرباعية

الملخص

المصدر: Zhang ، X. et al. ، فحص الوصلات أحادية المشبك في ذبابة الفاكهة باستخدام قنوات الصوديوم المقاومة للذبابة ذوقوت. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو اختبار الوصلات أحادية المشبك باستخدام ذبابة معدلة وراثيا. تحتوي الذبابة على قنوات صوديوم مقاومة للسموم الرباعية وقنوات تنشطها الضوء الأحمر في الخلايا العصبية قبل المشبكية ، والتي يتم تحجيمها بصريا لنقل الإشارات إلى الخلايا العصبية بعد المشبكي.

البروتوكول

1. إعداد الذباب وتحديد خطوط المروج GAL4

1. حدد خط محفز GAL4 وعبره بالذباب الذي يحمل كلا من الجين المعدل UAS-NaChBac والجين المعدل البصري للتنشيط.
   ملاحظه: تم اختيار UAS-CsChrimson نظرا لتوصيله العالي والسهولة التي ينشط بها إمكانات العمل بوساطة قناة الصوديوم المقاومة للرباعي السموم (TTX) (NaChBac). يتوفر كل من UAS-NaChBac و UAS-CsChrimson من مستودع Bloomington Stocks.
2. تحضير شبكية العين المتحولة بالكامل كمحلول مخزون في الإيثانول (35 ملم) وتخزين المحلول في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
3. امزج 28 ميكرولتر من هذا المرق في حوالي 5 مل من طعام رقائق البطاطس المعاد ترطيبه وأضف هذا الخليط إلى الجزء العلوي من قارورة ذبابة الفاكهة التقليدية.
4. قم بتربية الذباب البالغ الذي يعبر عن csChrimson على طعام يحتوي على 0.2 ملي مولار عبر الشبكية بالكامل لمدة 1-3 أيام.

2. تحضير مخزون TTX

1. قم بإنشاء محلول مخزون بحجم 1 ملي مولار TTX في ماء مقطر أو منزوع الأيونات. قم بتخزين هذا المحلول في ثلاجة المختبر لعدة أشهر. تحقق من سياسات المؤسسة فيما يتعلق بتخزين TTX ، حيث تصنف العديد من المؤسسات TTX على أنها مادة خطرة أو خاضعة للرقابة.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الذباب للفيزيولوجيا الكهربية

1. اجمع الذباب البالغ البالغ من العمر 1-3 أيام والذي يتم تربيته على الطعام باستخدام شبكية العين بالكامل.
2. ضع الذباب في قارورة زجاجية متلألئة. ضع القارورة على الثلج لمدة 1 دقيقة لشل حركة الذباب.
3. استخدم ملقطا خشنا لإدخال ذبابة في غرفة تسجيل مخصصة. تتكون الغرفة من ليزر دائري 3 1/2 بوصة مقطوع من أكريليك 1/16 بوصة. قم بقطع ثقب 3/4 بوصة في الوسط ، حيث يتم إرفاق رقائق معدنية مخصصة بجزء من الإيبوكسي. تحتوي الرقاقة على أمل مثلث الشكل يتم إدخال الذبابة فيه.
4. ضع الشمع أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) الايبوكسي القابل للعلاج حول لتثبيته بإحكام داخل غرفة التسجيل.
5. قم بإضاءة المستحضر بألياف ضوئية معقوفة للتصور تحت المجهر المجسم. اضبط الألياف المنحنية للإضاءة المائلة عن طريق تعديلها بحيث تضيء الذبابة مباشرة من الجانب.
6. اضبط مستوى الضوء على أدنى إعداد ممكن لا يزال يسمح بتصور واضح للذبابة. ستختلف شدة الضوء هذه باختلاف التجارب الفردية.
   ملاحظه: يمكن تكييف هذا البروتوكول باستخدام طريقة استنساخ الدماغ في الموقع.
7. استرداد محلول ملحي للتسجيل الخارجي. يحتوي المحلول الملحي في مللي مولار: 103 كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 3 كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 5 N-tris (هيدروكسي ميثيل) ميثيل -2- حمض أمينوإيثان سلفونيك ، 8 تريهالوز ، 10 جلوكوز ، 26 بيكربونات الصوديوم ، NaHCO₃ ، 1 فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم ، NaH₂PO₄ ، 1.5 كلوريد الكالسيوم ، كلوريد_{الكالسيوم 2} ، و 4 كلوريد المغنيسيوم ، MgCl₂ (معدل إلى 270-275 mΩ). المحلول الملحي يحتوي على 95٪ O₂/5٪ CO₂ (كربوجين) وله درجة حموضة معدلة إلى 7.3.
8. ضع 4-6 قطرات من محلول ملحي للتسجيل خارج الخلية فوق مستحضر الذبابة. في هذه المرحلة ، قم بزيادة مستوى الضوء في مجهر التشريح لتحسين الرؤية.
9. شحذ سلك التنغستن باستخدام التحليل الكهربائي. لصنع السلك ، قم بإعداد محلول مشبع من نترات البوتاسيوم ، KNO₃ وقم بتطبيق ما يقرب من 20 فولت من التيار المتردد (AC) أثناء غمس طرف السلك في المحلول 20 مرة لمدة 100 مللي ثانية لكل منهما حتى يتم شحذ الطرف. استخدم سلك التنغستن الحاد لإزالة البشرة على رأس الذبابة وبالتالي تعريض الدماغ.
10. كشف الدماغ بشكل أكبر عن طريق إزالة القصبة الهوائية والأجسام الدهنية المحيطة به. في حالة الوصول إلى فصوص الهوائي ، استخدم سلك تنجستن مثني أو أداة مماثلة لثني الهوائيات برفق أسفل غرفة تسجيل الرقائق لزيادة الرؤية. استخدم ملقطا حادا لتمزيق الغلاف الدبقي الذي يغطي منطقة الاهتمام حيث سيتم إجراء التسجيلات.
11. انقل غرفة التسجيل إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. ابدأ على الفور في التروية باستخدام محلول ملحي خارجي مغطى بالكربوجين للحفاظ على الدماغ. يتم وضع خزان المحلول الملحي فوق مرحلة المجهر ويتم تغذيته بالجاذبية للمستحضر. استخدم خطا مفرغا وقارورة إرلينماير سعة 2 لتر لجمع النفايات المالحة.

4. الحصول على تسجيل خلية كاملة

1. اسحب ماصات التصحيح على مجتذب ماصة تجاري. راجع الدليل لمعرفة الإعدادات للحصول على ماصة مناسبة مع مقاومة طرف قريبة من 7 mΩ.
2. أضف 4 ميكرولتر من محلول التسجيل الداخلي في ماصة رقعة. يتكون المحلول الملحي الداخلي من 140 أسبارتات البوتاسيوم ، و 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) ، و 4 أدينوسين ثلاثي فوسفات المغنيسيوم (MgATP) ، و 0.5 Guanosine 5'-triphosphate ثلاثي فوسفات ملح الهيدرات (Na₃GTP) ، و 1 حمض إيثيلين جلايكول الرباعي الأسيتيك (EGTA) ، و 1 كلوريد البوتاسيوم (KCl) في ملليمتر.
3. قم بإعداد مضخم مشبك التصحيح للتسجيل في الخلية الكاملة. قم بصفر إزاحة مكبر الصوت واضبط مكبر الصوت لتقديم نبضات الاختبار. هنا ، يتم استخدام مضخم مشبك التصحيح لأنظمة AM 2,400.
4. استخدم ضغطا إيجابيا من خلال الماصة واقترب من الخلية. استخدم معالجا دقيقا لتوجيه الماصة والاتصال بالخلية. حرر الضغط الإيجابي. اضبط إمكانات الاحتفاظ بالغشاء على -60 مللي فولت. يجب أن تشكل الماصة ختما جيجا أوم مع غشاء الخلية كما يتضح من تيار تثبيت منخفض للبيكوأمبير.
   ملاحظه: في حالة استخدام استهداف الخلايا الموجهة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، حاول تقليل استخدام ضوء epifluorescent لمنع ChR2 التنشيط والاكتئاب المشبكي المحتمل. انتظر أيضا بضع دقائق قبل تطبيق الخطوة 5.
5. اضبط مكبر الصوت لتوصيل نبضات الاختبار من -50 مللي فولت إلى -60 مللي فولت. هذا الإعداد قياسي في مكبرات الصوت ذات المشبك التصحيح. ستكشف نبضات الاختبار عن عابر سعوي كبير يمثل التيار اللازم لشحن ماصة التصحيح. قم بإزالة العابرين بالسعة عن طريق ضبط مقابض تعويض السعة على AM 2400 أو مكبر الصوت المماثل.
6. قم بتطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق غشاء الخلية والحصول على تكوين الخلية الكاملة. < / > ملاحظه: لوحظ تكوين خلية كاملة عندما تكون هناك زيادة كبيرة في العابرين بالسعة الذين يظهرون سعة الخلايا العصبية. من المحتمل أيضا ملاحظة زيادة طفيفة في التيار القابض (خط الأساس). اضبط مكبر الصوت على وضع المشبك الحالي واضبط إمكانات الخلية على -50 إلى -60 مللي فولت.

5. اختبار الاتصال المشبكي

1. قم بتكوين نظام الحصول على البيانات (DAQ) لتشغيل برنامج تشغيل الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) لتوليد نبضات ضوئية. هنا ، يتم استخدام نظام National Instruments DAQ مع Matlab لتوصيل إشارة تناظرية إلى برنامج تشغيل LED. يتم ضبط شدة LED عبر الإشارة التناظرية إلى السائق. LED عبارة عن مصباح LED بطول موجي 620-630 نانومتر.
2. ضع مؤشر LED الأحمر عالي الطاقة أسفل التحضير مباشرة. اضبط شدة الضوء بحيث يصل 0.238 ميجاواط / مم² إلى الذبابة.
3. تنشيط الخلايا العصبية قبل المشبكية أثناء التسجيل من خلية ما بعد المشبك ذات الاهتمام. تحقيق تنشيط الخلايا بصريا أو دوائيا أو عن طريق تحفيز الأعصاب. هنا ، يتم تطبيق csChrimson ونبضات قصيرة من الضوء الأحمر.
   ملاحظة: يمكن مراقبة التوصيلات المشبكية إما في المشبك الحالي كإمكانات ما بعد المشبكية المثيرة (EPSPs) أو مشبك الجهد كتيارات ما بعد المشبكي المثيرة (EPSCs). يجب أن يكون الاتصال المشبكي مرئيا قبل تطبيق TTX استجابة لنبضة ضوئية تبلغ 40 مللي ثانية. إذا لم يلاحظ أي اتصال ، فمن غير المحتمل أن تكون الخلايا العصبية متصلة بشكل متشابك إما أحادي أو متعدد المشابك. يمكن تعديل إمكانات الاحتفاظ للتأكيد على الوصلات المثيرة أو المثبطة وفقا لذلك.
4. إذا لوحظ اتصال في محلول ملحي عادي ، فأضف TTX إلى نظام التروية لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر. استخدم مضخة إعادة التدوير لالتقاط المحلول الملحي وإعادة استخدامه للحفاظ على TTX. ستقوم المضخة التمعجية بسحب المحلول الملحي من الحمام وإعادته إلى الخزان الملحي.
5. اضبط سرعة المضخة لتوفير فراغ ثابت قوي لا يسمح لمستوى المحلول الملحي في الحمام بالارتفاع والانخفاض.
   ملاحظه: يجب أن يؤدي تطبيق TTX إلى توقف نشاط الارتفاع في الخلايا العصبية التي تتم مراقبتها في الخلية بأكملها. هذا يؤكد أنه تمت إضافة ما يكفي من TTX إلى المحلول الملحي.
6. ضع نبضات قصيرة من الضوء الأحمر (40 مللي ثانية لكل نبضة) مرة أخرى. في هذه المرحلة ، من المحتمل أن يكون أي اتصال متشابك متبقي أحادي المشبك.

المواد