تسجيل التيارات المشبكية عند ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية

الملخص

المصدر: Vasin, A., et al. تسجيلات التصحيح البؤري للتيارات المشبكية من ذبابة الفاكهة اليرقة العصبية العضلية الوصلة العصبية. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية تسجيل التيارات المشبكية من عروة متشابكة عند التقاطع العصبي العضلي ليرقة ذبابة الفاكهة. تتيح هذه التقنية مراقبة نشاط عروة متشابكة واحدة ، وهو أمر مهم لدراسة خطوط الذباب الطافرة مع تعزيز النشاط المشبكي التلقائي أو غير المتزامن.

البروتوكول

1. تصنيع أقطاب التسجيل

1. سحب الأقطاب الكهربائية الزجاجية
   1. استخدم البروتوكول التالي لمجتذب القطب الكهربائي الدقيق (انظر جدول المواد):
      1. السطر 1: الحرارة 510 سحب - السرعة 30 مرة 250 ؛ السطر 2: تسخين 490 سحب - السرعة 30 مرة 250.
         ملاحظه: تتوافق الوحدات الزمنية مع 0.5 مللي ثانية لكل وحدة. الوحدات الأخرى نسبية. يجب ضبط قيمة الحرارة لكل خيوط بعد إجراء اختبار المنحدر.
   2. استخدم مجهرا (تكبير 35x) للتأكد من أن القطر الداخلي للقطب المسحوب يتراوح بين 7 - 10 ميكرومتر (الشكل 1 أ). قم بتخزين الشعيرات الدموية في حاويات مغلقة بإحكام لمنع تراكم الغبار.
2. تلميع النار
   1. الشعيرات الدموية لتلميع الحريق (80-90٪ من القيمة الحرارية القصوى لمدة 1-2 ثانية) باستخدام فورة دقيقة (انظر جدول المواد). تأكد من أن القطر الداخلي النهائي للقطب المصقول هو 5 ميكرومتر (الشكل 1 أ).
3. الانحناء
   ملاحظة: يتم إجراء انحناءين من أجل وضع القطب الكهربائي في الجزء العلوي من العضلة تحت هدف تكبير عالي.
   1. استخدم الجهاز الموضح في الشكل 1 ب. ثبت القطب الكهربائي في المناور وضع الطرف فوق الفتيل ، وليس لمسه.
   2. اضبط قيمة الحرارة على 60 - 70٪ من الحد الأقصى واضغط على دواسة الحدادة الدقيقة لمدة 1-2 ثانية (انظر جدول المواد) لتسخين الفتيل. استخدم إبرة على شكل حرف L لسحب طرف القطب برفق لأسفل (الشكل 1 ب مكبر). قم بالانحناء عند حوالي 90 درجة (الشكل 1 ج).
   3. أمسك القطب الكهربائي فوق لهب الشعلة يدويا باستخدام ملقط وقم بالانحناء الثاني على مسافة 7-10 مم من الانحناء الأول وبزاوية حوالي 120^درجة (الشكل 1C).

2. الخطوات التحضيرية الإضافية

1. تحضير محلول شبيه بالهيموليمف (HL3) (بالملليمتر): 70 كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 5 كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 20 كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) ، 10 كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO₃) ، 5 تريهالوز ، 115 سكروز ، 5 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) ، و 1 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 - 7.4. احتفاز بالمحلول في الثلاجة واجعله طازجا كل أسبوع.
2. اصنع ماصات التحفيز بنفس طريقة تسجيل الماصات الزجاجية ، إلا أنه لا داعي لثنيها.
   ملاحظه: يتم وصف إعداد أقطاب التحفيز بالتفصيل في 28 و 27. يجب أن يكون القطر النهائي بعد تلميع الحريق في حدود 5-7 ميكرومتر.
3. أدخل ماصة تحفيز في حامل قطب كهربائي دقيق متصل بحقنة.

< p class = "jove_title" >3. التسجيلات الكهربائية للتيارات الوصلية المثيرة (EJCs)

1. تسجيل
   1. ضع طبق بتري مع المستحضر على مرحلة المجهر (الشكل 2). أدخل القطب المرجعي في الحمام.
   2. املأ قطب التسجيل بمحلول HL3. تحت هدف 10x (انظر جدول المواد) ، اغمر القطب في الحمام وضعه فوق العضلات 6 و 7 من أجزاء البطن 2 أو 3 أو 4 باستخدام المعالج الدقيق (انظر جدول المواد) (الشكل 3 أ.1 و أ.2).
   3. قم بتبديل الهدف إلى 60x (انظر جدول المواد). ركز على مجال الاهتمام باستخدام بصريات epi-fluorescence أو DIC ضع طرف القطب الكهربائي أعلى العروة المشبكية (الشكل 3 ب 1-3).
   4. اضغط على القطب برفق شديد على العضلات. قد يؤدي الضغط المفرط إلى إتلاف الوصلة العصبية العضلية (NMJ) أو إحداث زيادة في النشاط المشبكي التلقائي. تأكد من عدم انسداد طرف القطب - إذا كان كذلك ، فاستبدله.
   5. قم بتشغيل مكبر الصوت ولوحة A / D والكمبيوتر.
   6. اختر وضع مشبك الجهد على مكبر الصوت.
   7. ابدأ برنامج الاستحواذ واختر وضع "خال من الفجوات".
   8. لاحظ ظهور التيارات الوصلية المثيرة المصغرة (mEJCs) على شاشة الكمبيوتر.
   9. تأكد من أن سعة mEJCs في حدود 0.2 - 0.7 نانو أمبير < br / > ملاحظه: تشير EJCs الأصغر إلى أن قطب التسجيل به عيوب أو أنه لم يتم وضعه بشكل صحيح.
2. التحفيز
   1. باستخدام معالج دقيق ، تحت التحكم البصري ، ضع قطب التحفيز بالقرب من أجزاء البطن العصبية 2-4.
   2. قم بالضغط السلبي عن طريق سحب مكبس المحقنة المتصلة بحامل القطب الكهربائي بحيث يتم سحب المحور العصبي داخل القطب الكهربائي (الشكل 2).
   3. قم بتشغيل المحفز. أدر المقبض الموجود على وحدة العزل (انظر جدول المواد) لضبط تيار صفري ، ثم قم بزيادته برفق حتى تظهر EJCs (أو حتى يتم الوصول إلى العتبة).
   4. قم بإجراء التحفيز في نظام فوق العتبة ، مع زيادة تيار التحفيز مرتين تقريبا ، مقارنة بعتبة مراقبة EJCs.
      ملاحظه: من خلال تجربتنا ، فإن شدة التحفيز هذه هي الأمثل لتجنب الفشل المحتمل في العمل وإطلاق النار المحتمل على العمل. على سبيل المثال ، إذا ظهرت EJCs بتيار التحفيز 0.2 مللي أمبير ، فاستخدم تيارا قدره 0.4 مللي أمبير طوال التجربة.

النتائج

الشكل 1. الخطوات النهائية لتصنيع الماصات الدقيقة. (أ) أطراف القطب بعد السحب وتلميع النار. (ب.1) إعداد ثني الطرف. (ب.2) تظهر المنطقة المعبأة مكبرة على اليمين. يتم تثبيت القطب الكهربائي والفتيل بحيث يتم وضع طرف القطب فوق السلك قليلا ولا يلمسه. (C.1) قطب التسجيل. (2.C) تظهر المنطقة المعبأة مكبرة على اليمين. يبلغ طول الم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مايكرو تورش 1WG61 محبب 1وو61 مايكرو تورش أوليمبوس BX61WI أوليمبوس BX61WI مجهر عمودي أوليمبوس لومبلان FL N 60x أوليمبوس UPLFLN 60X هدف المجهر 60X أوليمبوس UPlan FL N 10x أوليمبوس يوبلانفل إن 10X هدف المجهر 10X Narishige Micromanipulator ناريشيجي MHW-3 مناور دقيق هيدروليكي مائي ثلاثي المحاور إن بي آي إلكتروني جي إم بي إتش ELC-03XS npi Electronic GmbH ELC-03XS مكبر للصوت الفيزيولوجي الكهربي A.M.P.I ماستر 8 أ.م.ب.ي. ماجستير 8 المحفز الكهربائي A.M.P.I ISO-FLEX أ.م.ب.ي. ايزو فليكس عازل التحفيز طاولة TMC المضادة للاهتزاز TMC 63-9090 طاولة مضادة للاهتزاز TMC فاراداي قفص TMC 81-333-90 قفص فاراداي ديجيداتا 1322 أ أدوات محور ديجيداتا 1322 أ ديجيداتا حاسوب ديل ديل دايمنشن 5150 كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Win XP حامل القطب الكهربائي WPI MEH3SW حامل القطب الكهربائي مرشح بصري أوميغا البصرية XF 115-2 مكعب مرشح للكشف عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) pCLAMP 8 أدوات محور 8.0.0.81 برنامج لتسجيل الإشارات كوانتان البرمجيات الداخلية - برنامج لمعالجة الإشارات كانتون إس (Wildtype) مركز بلومنجتون للأوراق المالية 64349 خط الطيران التابع للتحكم cpx SH1 هدية سخية من جي تي ليتلتون - خط ذبابة الضربة القاضية المركب مع زيادة إفراز الخلايا التلقائي CD8-GFP مركز بلومنجتون للأوراق المالية 5137 م خط الطيران مع علامة الفلورسنت العصبي (GFP)