مقالة منهجية

تقنية مشبك التصحيح الآلية الموجهة بالصور لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Wu, Q., et al. تطبيق مشبك التصحيح الآلي الموجه بالصور لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ. J. Vis. Exp. (2017).

في هذا الفيديو ، يتم تثبيت شرائح الدماغ في غرفة التسجيل ، ويتم تحديد موقع الخلايا ذات الأهمية والتركيز عليها باستخدام مجهر يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر. ثم يقوم نظام معالجة الصور الآلي بوضع ماصة التصحيح بدقة لإغلاق غشاء الخلية ومراقبة الإشارات الكهربائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. إعداد النظام

  1. بناء وحدة التحكم في الضغط.
    1. قم بتجميع وحدة التحكم في الضغط وفقا لخريطة الدائرة (الشكل 1). لحام الأجزاء الضرورية على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) المصنعة وفقا لمخططات الدوائر الكهربائية (الشكل 1 ب). استخدم المقاومات القياسية ، ومصابيح LED (الثنائيات الباعثة للضوء) ، والترانزستورات ذات التأثير الميداني لأشباه الموصلات بأكسيد المعادن (MOSFETs) ، والمكثفات ، والموصلات. لحام صمامات الملف اللولبي على ثنائي الفينيل متعدد الكلور (لوحة الدوائر المطبوعة). قم بتوصيل مضخة الهواء ومستشعر ضغط الهواء بثنائي الفينيل متعدد الكلور بسلك كهربائي.
      ملاحظة: بعد توفر جميع الأجزاء الضرورية ، يجب بناء وحدة التحكم في الضغط في حوالي 2 ساعة.
  2. قم بتوصيل لوحة الحصول على البيانات الثانوية (DAQ).
    1. قم بتوصيل مخرجات البيانات من لوحة الدوائر المطبوعة بلوحة DAQ ، باتباع الجدول 1.
      ملاحظه: سيتم تشغيل لوحة DAQ في "الوضع أحادي النهاية". توجد خريطة المنفذ في دليل المستخدم (راجع جدول المواد).
    2. قم بتوصيل "AIn Pr S" بإحدى قنوات الإدخال التناظرية (الذكاء الاصطناعي) و "R-Gr" بإحدى الأسس التناظرية على لوحة DAQ الثانوية.
    3. قم بتوصيل الإخراج الأساسي من مكبر الصوت بإحدى القنوات الذكاء الاصطناعي والأرض بالأرض التناظرية للوحة DAQ الثانوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام كبل BNC قياسي لتوصيل الإخراج الأساسي من مكبر الصوت.
    4. قم بتجريد الطرف الآخر وقم بتوصيل الإشارة الموجبة (أي النواة النحاسية) بقناة الذكاء الاصطناعي والأرض (أي السلك الرفيع حول القلب) بالأرض التناظرية. كرر هذه الخطوة لقناة ثانية إذا تم إستخدام أكثر من قناة تصحيح واحدة.
      ملاحظة: سيتم تكوين الإدخال التناظري للوحة DAQ في الخطوات اللاحقة.
    5. قم بتوصيل الطاقة بخرج الطاقة للوحة DAQ الثانوية. استخدم مصدر طاقة منفصل بجهد 12 فولت للمضخة.
  3. قم بتوصيل الأنبوب.
    1. قم بتوصيل مضخة الهواء والصمامين.
    2. في الخطوة الأخيرة، استخدم موصل ثلاثي الاتجاهات لتوصيل الأنبوب الناعم من المنفذ العلوي للصمام 2 بمستشعر الضغط وحامل الماصة.
    3. إذا تم استخدام ماصتين، فأضف موصل آخر ثلاثي الاتجاهات إلى الأنبوب المتصل بحامل الماصة. عند الترقيع، قم بالتبديل يدويا بين الصمامات والماصات المستخدمة.
  4. قم بتثبيت Autopatcher IG.
    ملاحظة: متطلبات النظام: تم اختبار Autopatcher IG فقط على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Windows 7. لم يتم التحقق من صحتها لأنظمة التشغيل الأخرى. ينطبق الإجراء الموصوف على وجه التحديد على الأجهزة المدرجة في جدول المواد.
    1. قم بتنزيل Autopatcher-IG من GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
    2. قم بتثبيت Python (راجع جدول المواد للإصدار وعنوان التنزيل).
    3. قم بإلغاء تثبيت مكتبة PyQt4 عن طريق كتابة "pip uninstall PyQt4" في محطة سطر الأوامر.
      ملاحظه: يستخدم النظام إصدارا قديما من مكتبة PyQt4 لتحقيق التوافق مع مكتبات Qwt و Opencv.
    4. قم بتثبيت مكتبات Python من ملفات العجلات التاريخية (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). ابحث عن الملفات التالية: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl) و Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl) و Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) و Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. لتثبيت ملفات العجلة ، انتقل إلى الدليل حيث يتم حفظ الملفات واكتب "pip install ***wheelfilename ***.whl." استبدل "***wheelfilename***" بالاسم الفعلي للملف.
        ملاحظة: يشير "cp27" في اسم ملف العجلة إلى Python 2.7 ، ويشير "win32" إلى Windows 32 بت. إذا لم ينجح "win32" ، فجرب "win64".
    5. للتحكم في كاميرا CCD (الجهاز المقترن بالشحن)، قم بتنزيل برنامج التثبيت وتثبيته لإصدار 64 بت (https://www.qimaging.com/support/software/). ثم قم بتنزيل MicroManager ل 64 بت (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) للتحكم في الكاميرا في Python.
    6. للتحكم في المتلاعبين ومرحلة المجهر ، قم بتثبيت برنامج التحكم المقدم من الشركة المصنعة.
      ملاحظه: من خلال القيام بذلك ، يتم أيضا تثبيت برنامج التشغيل الضروري للتحكم في المتلاعبين. عادة ما يتم توفير حزمة التثبيت في قرص مضغوط.
    7. للتحكم في لوحة DAQ الثانوية، قم بتثبيت المكتبة العامة من قرص مضغوط ، مزود بشراء لوحة DAQ.
  5. قم بتكوين الأجهزة ل Autopatcher IG.
    1. قم بتوصيل مرحلة المجهر ووحدات التحكم في المنااور بالكمبيوتر عبر منافذ USB.
    2. قم بتعيين أرقام منافذ COM إلى الوحدة 0: مرحلة المجهر، والوحدة 1: المناور الأيسر، والوحدة 2: المناور الأيمن، بهذا الترتيب، في ملف التكوين "ports.csv" في مجلد "التكوين". اترك المعلمات الأخرى في ملف ports.csv (أي "SCI" و "1") دون تغيير.
      ملاحظه: يمكن العثور على معلومات رقم منفذ COM عن طريق تشغيل برنامج تكوين المناور الذي توفره الشركة المصنعة. انتقل إلى علامة التبويب "الإعدادات" ، وحدد "الإعدادات" وصفحة "الحركة" ، واقرأ التسميات لكل علامة تبويب في الأعلى. بدلا من ذلك، يمكن العثور على هذه المعلومات في إدارة أجهزة الكمبيوتر.
    3. قم بتعيين أرقام قنوات الإدخال التناظرية على لوحة DAQ لمستشعر الضغط وقناة التصحيح 1 و 2 (المقابلة للوحدانتين 1 و 2). أدخل رقم القناة في الملف "DAQchannels.csv" في مجلد "التكوين".
      ملاحظه: يوصى بفتح ملفات .csv باستخدام تطبيق Notepad بدلا من جدول البيانات ، حيث قد يغير المعلومات عند حفظ التغييرات.
  6. قم بتشغيل Autopatcher IG.
    1. قم بتشغيل مكبر الصوت ووحدة التحكم في المجهر ووحدة التحكم في المناويل. تأكد من تشغيل برنامج مكبر الصوت.
    2. قم بتشغيل Autopatcher IG باستخدام Python من محطة سطر الأوامر على النحو التالي: أولا ، قم بتغيير الدليل (الأمر "cd" لمعظم المحطات الطرفية الشائعة) حيث تم تثبيت Autopatcher IG ، واكتب "python Autopatcher_IG.pyw" في محطة سطر الأوامر ، واضغط على مفتاح "Enter".
      ملاحظة: لا تقم بتشغيل برنامج التحكم في المناور قبل تشغيل Autopatcher IG لأنه سيشغل مرحلة المجهر والمناوي، مما يتسبب في عدم قدرة Autopatcher IG على العثور على الجهاز. يمكن تشغيل برنامج التحكم في Manipulator بعد بدء تشغيل Autopatcher IG بالكامل إذا كانت هناك وحدات إضافية يجب التحكم فيها (على سبيل المثال ، السخان المضمن).
  7. معايرة الماصة الأولية.
    1. سحب ماصات التصحيح. املأ ماصة زجاجية مسحوبة بمحلول داخلي وقم بتحميلها على مرحلة الرأس.
      ملاحظة: الماصات الزجاجية الفارغة لها تباينات مختلفة تحت المجهر وقد تؤدي إلى معايرة غير دقيقة.
    2. حرك طرف الماصة إلى المجال البصري للمجهر واجعله في بؤرة التركيز. إذا تم استخدام لوحة الاتصال لتحريك المتلاعبين و / أو مرحلة المجهر ، فقم بتحديث الإحداثيات بالضغط على "z" على لوحة المفاتيح.
      ملاحظه: هذا الإجراء ليس ضروريا إذا تم استخدام لوحة المفاتيح (مرحلة المجهر: A / D - المحور x ، W / S - المحور y ، R / F - المحور z ؛ المتلاعبات: H / K - المحور x ، U / J - المحور y ، O / L - المحور z ، 1/2 - رقم الوحدة) للتحكم في الحركة لأنه سيتم تحديث الإحداثيات في الوقت الفعلي.
    3. انقر فوق الزر "بدء المعايرة" في واجهة مستخدم الرسومات الرئيسية (GUI) للوحدة المقابلة التي تم تحميل الماصة عليها (الشكل 2).
      ملاحظه: ستظهر نافذة منبثقة عند انتهاء المعايرة.
      ملاحظة: سيتم إجراء المعايرة تلقائيا ، والتي ستستغرق حوالي 3.5 دقيقة. سيؤدي النقر فوق نفس الزر (تم التبديل الآن إلى "إلغاء المعايرة" بعد بدء المعايرة) إلى إجهاض محاولة المعايرة.
    4. احفظ المعايرة بالنقر فوق "حفظ المعايرة" في الجزء السفلي من واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية (يحفظ المعايرة الحالية لكلا المتلاعبين ويمكن تحميله في المستقبل).
      ملاحظة: يجب محاذاة مجال الرؤية تحت التكبير المنخفض (4 أو 10X) والعالي (40X) حتى تعمل المعايرة الثانوية بشكل صحيح. يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم الخاص بالنظام البصري المستخدم لإجراءات المحاذاة.
       
< p class = "jove_title" >2. إجراء مشبك التصحيح التلقائي

  1. تحضير شرائح الدماغ الحادة
  2. قم بإعداد الماصات الزجاجية لمشبك التصحيح.
  3. ضع شريحة دماغ واحدة في وسط غرفة التسجيل. قم بتثبيت الشريحة بشريحة باستمرار أو "قيثارة".
  4. كشف الخلية الفلورية.
    1. ابحث عن مجال الاهتمام تحت عدسة 4X. حرك مرحلة المجهر عن طريق تشغيل وضع النقر للنقل ("CTM") والنقر فوق مركز منطقة الاهتمام. بدلا من ذلك ، استخدم لوحة المفاتيح لتحريك مرحلة المجهر (A / D - المحور x ، W / S - المحور y ، R / F - المحور z).
    2. قم بالتبديل إلى العدسة عالية التكبير واضبط التركيز البؤري عن طريق تحريك المجهر في المحور z، باستخدام R/F على لوحة المفاتيح.
      ملاحظة: يوصى بضبط مستوى الحمام المائي بحيث يكون المستوى البؤري الموجود أسفل عدسات التكبير المنخفضة والعالية متماثلا أو مشابها في المحور z.
    3. انقر فوق الزر "اكتشاف الخلية" في عمود واجهة المستخدم الرسومية الرئيسي ، "الوحدة 0". إذا تعذر التحكم في مصدر ضوء LED أو الليزر للإعداد بواسطة إشارة TTL ، فقم بتشغيل LED / الليزر يدويا ؛ ستظهر نافذة منبثقة عند الانتهاء من اكتشاف الخلية.
      1. قم بإيقاف تشغيل LED / الليزر إذا لزم الأمر ؛ ستظهر قائمة بإحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية "مواضع الذاكرة". قم بإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من القائمة بالنقر فوق الزر "X" بجوار الإحداثيات.
      2. بدلا من ذلك ، إذا لم يتم تصنيف الخلايا المستهدفة بالفلورسنت ، فانقر فوق "وضع الماوس" على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. انقر فوق الخلية محل الاهتمام ؛ ستظهر نقطة صفراء برقم على الخلية ، وستظهر إحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية "مواضع الذاكرة".
  5. معايرة الماصة الثانوية.
    1. املأ 1/3 ماصة زجاجية بمحلول داخلي. قم بتحميل الماصة على حامل الماصة المتصل بمرحلة الرأس.
    2. استخدم العدسة منخفضة التكبير. أحضر الماصة إلى المجال المرئي واضبط التركيز البؤري باستخدام لوحة المفاتيح (H/K - المحور x، U/J - المحور y، O/L - المحور z). استخدم "1" و "2" للتبديل بين الوحدة 1 والوحدة 2.
    3. قم بتحميل المعايرة الأساسية بالنقر فوق "معايرة التحميل". انقر فوق الزر "المعايرة الثانوية" في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية أسفل الوحدة المستخدمة. على سبيل المثال، إذا كانت الوحدة 2 قيد الاستخدام، فانقر فوق الزر "المعايرة الثانوية" في عمود "الوحدة 2". اتبع تعليمات النافذة المنبثقة للتبديل إلى العدسة عالية التكبير.
  6. تصحيح خلية مستهدفة.
    1. تأكد من تشغيل برنامج "MultiClamp" (أي مكبر الصوت). انقر فوق الزر "التحكم في التصحيح" لفتح واجهة المستخدم الرسومية "التحكم في التصحيح" ؛ قد يستغرق فتح واجهة المستخدم الرسومية هذه ما يصل إلى بضع دقائق.
    2. استخدم عدسة التكبير 40X عن طريق تحديد "40X" في عمود واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية "الوحدة 0". انقر فوق الزر "الانتقال إلى" بجوار الخلية محل الاهتمام في قائمة الإحداثيات في واجهة المستخدم الرسومية "موضع الذاكرة" ؛ سينتقل المجهر إلى الخلية.
    3. انقر فوق الزر CTM للوحدة المستخدمة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية لتمكين الحركة بعد نقرة الماوس. انقر فوق الخلية محل الاهتمام ؛ سينتقل طرف الماصة إلى الخلية.
    4. انقر فوق الزر "تصحيح" في واجهة المستخدم الرسومية "التحكم في التصحيح" .
      ملاحظه: سيبدأ التصحيح التلقائي ، ويمكن مراقبة الضغط والمقاومة على واجهة المستخدم الرسومية "التحكم في التصحيح".
      1. استخدم الزر "الوحدة 1 المحددة" لتبديل إشارة الإدخال بين الوحدتين.
        ملاحظة: سيقترب النظام من الخلية المستهدفة ، ويطبق ضغطا سلبيا ، ويطابق إمكانات غشاء الخلية ، ويكتشف تكوين الجيجاسيل بناء على سلسلة من عتبات الضغط والمقاومة والمنطق.
        2. قم
      2. بمعالجة العملية التلقائية في أي وقت من خلال النقر على الأزرار المعنية في واجهة المستخدم الرسومية "التحكم في التصحيح". على سبيل المثال ، انقر فوق الزر "تصحيح" مرة أخرى لإلغاء الإصدار التجريبي من التصحيح وانقر فوق "المرحلة التالية" لتقدم عملية التصحيح إلى الخطوة التالية ، بغض النظر عن الحد الأدنى.
        ملاحظة: ستقوم نافذة منبثقة بإخطار المستخدم عند تكوين gigaseal ، وسيتم تقديم خيار تطبيق zap جنبا إلى جنب مع الضغط السلبي الكبير.
    5. حدد "نعم" للاقتحام مع الجمع بين الانطلاق والشفط. بدلا من ذلك ، حدد "لا" للاقتحام بالشفط فقط.
      ملاحظة: عند اكتمال تصحيح ناجح للخلية بأكملها، ستقوم نافذة منبثقة بتذكير المستخدم بحفظ سجل تصحيح التجربة.
    6. احفظ سجل تصحيح التجربة.
      ملاحظة: إذا لم تنجح نسخة تجريبية من التصحيح، فستقوم نافذة منبثقة بإعلام المستخدم، وستتم إعادة تعيين عملية التصحيح.
    7. ارجع إلى الخطوة 2.4 وكرر الخطوات بخلية مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" > الجدول 1. لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) إلى تكوين اتصال لوحة الحصول على البيانات الثانوية (DAQ). استخدم هذا الجدول لتوصيل مخرجات ثنائي الفينيل متعدد الكلور (العمود الأول من اليسار) بالمنافذ الموجودة على لوحة DAQ (العمود الثاني من اليسار). يشير اسم المنفذ ورقمه في DAQ الثانوي إلى الوضع أحادي النهاية.

منفذ على ثنائي الفينيل متعدد الكلور اسم المنفذ على لوحة DA...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كاميرا CCD تشي ماجينغ روليرا بولت جهاز الفيزيولوجيا الكهربية علمية سلايسكوب برو 2000 تشمل المجهر والمتلاعبين. قدمت الشركة المصنعة برنامج التحكم في المناوير الموضح في هذه المخطوطة هو "Linlab2". مكبر الأجهزة الجزيئية MultiClamp 700B مضخم القطب الكهربائي الصغير الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر محول الأرقام الأجهزة الجزيئية أكسون ديجي داتا 1550 مصدر ضوء LED LED بارد [بE-100] الطول الموجي 488 نانومتر لوحة الحصول على البيانات حوسبة القياس USB1208-FS الثانوية DAQ.
انظر الدليل في : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf صمامات الملف اللولبي شركة لي LHDA0531115H مفرغة الهواء الصناعة الافتراضية VMP1625MX-12-90-CH مستشعر ضغط الهواء أشباه الموصلات الحرة MPXV7025G الضغط باستمرار على الشريحة أدوات وارنر 64-1415 (SHD-40/2) طقم تثبيت الشرائح، مسطحة لغرفة RC-40، 2.0 مم، 19.7 مم بايثون اناكوندا الإصدار 2.7 (32 بت لنظام التشغيل Windows) https://www.continuum.io/downloads محطات المسمار (2 دبوس) سبارك فان بي آر تي - 08084 محطات المسمار 3.5 مم الملعب (2 دبوس) N-Channel MOSFET 60V 30A سبارك فان كوم - 10213 DIP Sockets ذيل اللحام - 8 سنون سبارك فان بي آر تي -07937 LED - أحمر أساسي 5 مم سبارك فان COM-09590 LED - أخضر أساسي 5 مم سبارك فان COM-09592 جاك / موصل طاقة برميل DC (SMD) سبارك فان PRT-12748 محول حائط مزود الطاقة - 12VDC 600mA سبارك فان رقم TOL-09442 سلك التوصيل - تشكيلة (نواة صلبة ، 22 AWG) سبارك فان PRT-11367 قفل ذكر × أنثى × أنثى محبس ARK-PLAS RCX10-GP0 فيشربراند Tygon S3 E-3603 أنابيب مرنة فيشر علمي 14-171-129 القطر الخارجي: 1/8 بوصة < / > القطر الداخلي: 1/16 بوصة. BNC ذكر إلى BNC ذكر الكابل المحوري مكونات Belkin F3K101-06-E 560 أوم المقاوم (5٪ تسامح) راديوشاك 2711116 بيكوسبريتزر الصمام العام بيكوسبريتزر الثاني

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة