التسجيل الفيزيولوجي الكهربي من الأعصاب الواردة في القولون الموجود في القولون الفئران السابق في الجسم الحي

الملخص

المصدر: Meng ، Y. et al. ، التوصيف في المختبر للخصائص الفيزيولوجية الكهربية للألياف الواردة القولون في الفئران. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتسجيل نشاط الأعصاب الواردة في القولون الوارد في القولون الفئران خارج الجسم الحي ، المقنية من كلا الطرفين وغمرها بالمحلول الملحي لزيادة الضغط داخل اللمعة. مع زيادة الضغط ، ترتفع الإشارة العصبية ، مما يشير إلى تحفيزها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير محلول التروية ومركبات الاختبار

1. تحضير 5 لتر من محلول كريبس: 113 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 5.9 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 1.2 ملي فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين ، NaH₂PO₄ ، 1.2 ملي كبريتات المغنيسيوم ، MgSO₄ ، 25 ملي بيكربونات الصوديوم ، NaHCO₃ ، 1.2 ملي كلوريد الكالسيوم ، كلوريد الكالسيوم₂ ، و 11.5 ملي جلوكوز. قم بتشبع المحلول بخليط غاز 95٪ O₂ + 5٪ CO₂. قم بتبريد ~ 500 مل من كريبس المؤكسج في الثلاجة.
2. تحضير كميات من مركبات اختبار المخزون (1 ملي مولار كبسيسين في الإيثانول و 10 ملي مولار 5-هيدروكسي تريبتامين (5-HT) في محلول ملحي) حسب الحاجة. قم بتخفيف المرق في كريبس (لتطبيق الحمام) وفي محلول ملحي (للإعطاء داخل اللمعة) إلى التركيز النهائي قبل الاستخدام مباشرة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير قطب التسجيل

1. اسحب قطب التسجيل من الأنابيب الزجاجية القياسية بدون خيوط داخلية (القطر الخارجي 1.5 مم) باستخدام مجتذب قطب كهربائي تقليدي. اضبط إعدادات الساحب للحرارة والسحب بحيث يتراوح ساق الأقطاب الكهربائية المسحوبة بين 20 و 25 مم.

فئة

3. جمع الأنسجة

1. تخدير الفئران بعمق باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم (80 مجم / كجم ، IP).
2. مع ضمان العقم ، قم بتعريض تجويف البطن عن طريق إجراء شق خط الوسط على جدار البطن باستخدام مشرط. اسحب المساريق والأنسجة الأخرى جانبا لكشف القولون والمستقيم.
3. ضع تحت مجهر التشريح. من خلال التشريح الدقيق ، حدد موقع العقدة الحوضية اليسرى (PG) وحدد أعصاب الحوض (PN) والأعصاب الحشوية القطنية (LSN) التي تنضم إليها. اقطع هذه الأعصاب على بعد بضعة ملليمترات من PG.
   ملاحظه: يقع PG بالقرب من تقاطع القولون والمستقيم. عادة ، 3-4 PN من الحبل الشوكي القطني العجزي ومشروع LSN إلى PG (الشكل 1).
4. قطع عظم الارتفاق لفضح المستقيم. إزالة الأنسجة (أي المثانة البولية ، إلخ) فوق القولون والمستقيم ؛ احرص على ترك PG سليما.
5. التضحية بالجرذ عن طريق الحقن الوريدي لجرعة زائدة من البنتوباربيتال. قم بتمرير القولون على ارتفاع حوالي 3 سم فوق PG وإزالة القولون والمستقيم من باستخدام الملقط.
6. انقل القولون إلى طبق بتري مليء بمحلول كريبس المبرد مسبقا. قم بإزالة البراز عن طريق شطف القولون برفق. قم بإزالة المثانة البولية المتبقية والأنسجة الأخرى بعناية ، دون المساس ب PG.

< p class = "jove_title" >4. تشريح الأعصاب الواردة القولون

1. ضع القولون في غرفة تسجيل (20 مل) وقم بدمج الأنسجة باستمرار بمحلول كريبس المكربن. اضبط معدل التروية على 15 مل / دقيقة.
2. قنية القولون والمستقيم في كل من الأطراف الفموية والشرجية. ابدأ التسريب داخل اللمعة للقولون بالمحلول الملحي بمعدل 10 مل / ساعة في الاتجاه الفموي إلى الشرج.
3. حدد موقع PG الرئيسي تحت مجهر التشريح. استخدم دبابيس الحشرات لفضح العقدة. مع التشريح الدقيق ، ابحث عن فرع رفيع من العصب ينبعث من العقدة ويمتد نحو القولون (الشكل 1). قطع العصب بالقرب من العقدة.
   ملاحظة: يوضح الشكل 1 تسجيلا من فرع عصبي بعيد إلى PG. من المفترض أن يحتوي العصب على مزيج من الألياف الواردة الحبوية الحوزية القطنية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تسجيل من PN و / أو LSN القريب من PG.
4. قم بتشغيل حمام التدفئة وقم بتسخين محلول كريبس للحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 34 ± 0.5 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >5. تحضير قطب الشفط

1. خذ ماصة زجاجية مسحوبة مسبقا (الخطوة 2) وفحصها تحت المجهر التشريح. اكسر طرف القطب الكهربائي بزوج من الملقط بحيث يكون بحجم متوافق مع قطر العصب المراد تسجيله.
2. شطبة الطرف عن طريق وضعه بالقرب من توهج أخف.

< ص الفئة = "jove_title" >6. التسجيل الكهربية

1. قم بتوصيل القطب المشطوف بحامل القطب. قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بالمنفذ الجانبي على الحامل لتطبيق ضغط سلبي أو إيجابي على القطب.
2. قم بتوصيل الحامل بمقدمة مكبر الصوت الحيوي وقم بتركيب المنصة الأمامية على مناور.
3. انقل القطب إلى حمام المناديل واملأ القطب بمحلول كريبس عن طريق تطبيق شفط لطيف حتى يلامس السلك الفضي للحامل. ضع طرف القطب بالقرب من الطرف المقطوع للعصب واضغط سلبا لامتصاص العصب في القطب. قم بتطبيق المزيد من الضغط السلبي بحيث يتم سحب ~ 1 مم من العصب إلى القطب الكهربائي وتشكيل ختم محكم.
4. قم بتشغيل مكبر الصوت الحيوي واضبط المرشح على 300 - 3,000 هرتز. راقب الإشارة الموجودة على راسم الذبذبات وسجل الإشارة العصبية (معدل أخذ العينات 20 كيلو هرتز) وإشارة الضغط داخل اللمعة (معدل أخذ العينات 100 هرتز) باستخدام جهاز كمبيوتر مزود ببرنامج معالجة بيانات سبايك.

< p class = "jove_title" >7. اختبار حساسية القولون الوارد

1. قم بتطبيق انتفاخ منحدر القولون عن طريق إغلاق الصنبور ثلاثي الاتجاهات على قنية المخرج مع النقع المستمر داخل اللمعة. راقب الضغط داخل اللمعة حتى يصل إلى 60 مم زئبق ، وفي ذلك الوقت افتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات على قنية التصريف.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. التسجيل الفيزيولوجي الكهربي للأعصاب الواردة في القولون الفئران في المختبر. أ. رسم تخطيطي لتحضير القولون "الأنبوبي" للفئران خارج الجسم الحي. يتم دمج القولون ، مع PG المرفق ، في غرفة التسجيل ويتم تعبيه من كلا الطرفين. يتم تحقيق التسريب داخل اللمعة باستخدام مضخة حقنة ويتحرك في اتجاه الفم إلى الشرج. يتم انتفاخ القولون عن طريق إغلاق الصنبور ثلاثي الاتجاهات (د...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات البنتوباربيتال الصوديوم شنغهاي ويستانج للتكنولوجيا الحيوية ب 558 كابسيسين سيغما M2028 مجتذب القطب الكهربائي MicroData Instrument Inc PMP107 نظام الأعصاب (Bioamplifier) Digitimer ، المحدودة نظام الأعصاب محول A / D كامبريدج للتصميم الإلكتروني مايكرو 1401 برنامج معالجة البيانات كامبريدج للتصميم الإلكتروني Spike2 الإصدار 6 سلك فضي أدوات الدقة العالمية الحلقة 12 أنابيب زجاجية أدوات الدقة العالمية 1ب 150-4 حامل القطب الكهربائي أدوات الدقة العالمية MEH3SBW حمام التدفئة وهب جي 150 تشريح المجهر لايكا زووم2000 تشريح المجهر أدوات الدقة العالمية PZMIII-BS ولاعة السجائر أي غير أ الأدوات الجراحية أدوات الدقة العالمية غير أ دبابيس الحشرات محلي الصنع من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ 0.1 مم غير أ مناور ثلاثي الاتجاهات أدوات الدقة العالمية KITF-R جرذان أي غير أ يمكن استخدام أي سلالة / جنس.