تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا البطانية الوعائية الدماغية

الملخص

المصدر: Rellick، S. L. et al. تقييم وظيفة الطاقة الحيوية في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدماغية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تقييم أداء الميتوكوندريا للخلايا البطانية الوعائية الدماغية (CVE) باستخدام مقايسة التدفق خارج الخلية. يتم طلاء خلايا CVE في لوحة زراعة خلايا التدفق خارج الخلية. يتم ترطيب مستشعرات التدفق خارج الخلية قبل التحميل والمعايرة في المحلل الحيوي. ثم يتم تحميل اللوحة التي تحتوي على خلايا للتحليل.

البروتوكول

فئة

1. بذور وعلاج الخلايا البطانية الوعائية الدماغية (CVE) على ألواح زراعة الخلايا

1. خلايا بذور CVE (خلايا bEnd.3) على صفيحة زراعة خلايا تدفق خارج الخلية 96 بئر: 80 ميكرولتر / بئر. ضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪. ملاحظة: 16 × 10³ خلايا لكل بئر ستصل إلى 60-80٪ من التقاء في غضون 24 ساعة.
2. إذا تعرضت الخلايا لمادة كيميائية ، فأضف العلاجات بمجرد ربط الخلايا بقاع اللوحة (8-24 ساعة بعد البذر).
   ملاحظه: بالنسبة لتجارب التعدي ، لا تضيف المضادات الحيوية في وسط نمو كامل.

2. تقييم وظيفة الميتوكوندريا باستخدام المحلل الحيوي

1. قبل بدء الفحص ، قم بترطيب خرطوشة مستشعر التدفق خارج الخلية باستخدام العيار عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول التدفق خارج الخلية إلى اللوحة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. باستخدام محطة غسيل اللوحة ، قم بتغيير وسط زراعة الخلية إلى وسط فحص التدفق خارج الخلية بدرجة الحموضة 7.0. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30-60 دقيقة.
3. تحضير محاليل عمل من 8 ميكرومولار أوليغومايسين ، 4.5 ميكرومتر كربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، 10 ميكرومتر روتينون ، و 10 ميكرومتر أنتيمايسين أ في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو. قم بتحميل 25 ميكرولتر من محاليل المخزون في منافذ حقن الخرطوشة: المنفذ A ، oligomycin ؛ المنفذ B ، FCCP ؛ المنفذ C ، والروتينون ، وantimycin A مع وسيط فحص التدفق خارج الخلية. تنفيذ بروتوكول الفحص كما هو موضح في الجدول 1.
4. قم بتحميل الخرطوشة الرطبة في المحلل الحيوي وقم بإجراء المعايرة بالنقر فوق الزر "ابدأ". بعد اكتمال المعايرة، قم بإزالة اللوحة السفلية للخرطوشة وقم بتحميل لوحة الخلية بالنقر فوق موجه "تفريغ الخرطوشة". استمر في الفحص حتى تكتمل جميع القياسات.
5. افتح ملف البيانات واحصل على قيم المعدل من المحلل الحيوي. تصدير البيانات إلى ملف جدول بيانات.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. بروتوكول تشغيل الأداة. < p class = "jove_content" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات bEnd.3 خط الخلية ATCC علامة الإقليم - 2299 25-30 مقطعا وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ATCC 30-2002 مصل الأبقار الجنينية أتلانتا بيولوجيكس S12450 10٪ في النهائي البنسلين / ستيبتومايسين هيكلون SV30010 1×100 تخزين 0.25٪ تريبسين 0.03٪ محلول EDTA كورنينج 25-053-CI بيروفات الصوديوم كورنينج 25-000-CI 1.0 ميكرومتر في النهائي الجلوكوز سيغما سجل المستخلصات الكيميائية 50-99-7 25 ملي مولار في النهائي أوليغومايسين سيغما [أ4876] 1.0 ميكرومتر في النهائي الكربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) سيغما سي 2920 0.5 ميكرومتر في النهائي روتينون سيغما R8875 1.0 ميكرومتر في النهائي أنتيمايسين أ سيغما سجل المستخلصات الكيميائية 1397-94-0 1.0 ميكرومتر في النهائي محطة غسيل الألواح فرس البحر البيولوجي التحليل الحيوي للتدفق خارج الخلية فرس البحر البيولوجي XFe96 لوحة زراعة خلايا التدفق خارج الخلية فرس البحر البيولوجي هاتف: 102416-100 خرطوشة مستشعر التدفق خارج الخلية فرس البحر البيولوجي هاتف: 102416-100 محلول العيار خارج الخلية فرس البحر البيولوجي 100840-000 وسيط فحص التدفق خارج الخلية فرس البحر البيولوجي هاتف: 102365-100 تم تخزين الأس الهيدروجيني قبل الفحص