تسجيل نشاط العصب الوارد المساريقي في مقطع الصائم الفأر خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Nullens، S.، et al. التسجيل في المختبر لنشاط العصب الوارد المساريقي في الأجزاء الصائمة والقولونية للفأر. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو عملية تسجيل الإشارات الكهربائية من الأعصاب الواردة المساريقية في جزء صائمي مفصل للفأر لدراسة تأثيرات ضغط الأنسجة وتغيرات الحركة على نشاط العصب الوارد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير العصب الوارد الصائم

1. إجراء القتل الرحيم للقوارض المراهقة أو البالغة التي تمت الموافقة عليها قبل التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية (على سبيل المثال ، التخدير النهائي متبوعا بالثقب القلبي ، وخلع عنق الرحم ، وما إلى ذلك).
   ملاحظه: استخدمنا خلع عنق الرحم للتضحية بالحيوانات ، مما أدى إلى تجارب دون الحاجة إلى مزيد من التخدير أو رعاية ما بعد الجراحة حيث تتم معالجة الأنسجة بشكل أكبر في المختبر.
   ملاحظه: لقد ثبت أن العمر يخفف من الوظائف الحسية الميكانيكية الواردة المساريقية ، لذلك ننصح الباحثين بالالتزام بفئة عمرية معينة طوال مدة تجربة واحدة.
2. ضع المختبر المضحى به في وضع الاستلقاء وقم بإجراء شق خط الوسط في البطن عبر الجلد وطبقة عضلات البطن باستخدام مشرط ، يمتد من عملية الخنجري حتى عظم العانة.
3. استحم تجويف البطن بمحلول كريبس البارد لمنع الأنسجة داخل البطن من الجفاف (تكوين كريبس: 120.03 ملي كلوريد الصوديوم ، 6.22 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.57 ملي هيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ ، 15.43 ملي NaHCO₃ ، 1.21 ملي ملي MgSO₄ ، 11.52 ملي مولار D-glucose و 1.52 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2}).
4. استئصال الصائم بالكامل بسرعة باستخدام مقص حاد عن طريق استئصال ما يقرب من 20 سم من الأمعاء الدقيقة بدءا من مسافة مباشرة من ثني الاثني عشر الصائمي ، مع الحرص على عدم إتلاف الهياكل المحيطة والحفاظ على المساريق في الأمعاء ، الذي يحتوي على الأوعية الدموية الصائمية والأعصاب الواردة ، سليمة.
   ملاحظه: لمجرد تشريح الصائم في تجويف البطن ، لا يحتاج المرء إلى استخدام مجهر مجسم ، حيث يمكن تصور ذلك بسهولة بالعين المجردة.
5. ضع الصائم المستأصل في محلول كريبس المثلج واحتفظ به على الجليد مع أكسجة محلول كريبس باستمرار بالكربوجين (95٪ O₂ ، 5٪ CO₂).
6. قطع الصائم بمقص حاد في حلقات طولها حوالي 3 سم. راقب الحزمة المساريقية التي تحتوي على الأوعية والعصب الحشوي في مكان ما بالقرب من مركز الحلقة المعنية.
7. اغسل كل جزء بمحلول كريبس باستخدام قسطرة غير حادة لإزالة المحتويات اللمعية والكيموس ، لأنها تحتوي على إنزيمات هضمية من شأنها تسريع تدهور عينة الأنسجة في المختبر.
   ملاحظه: احرص على عدم إتلاف تجويف الحلقة أثناء التنظيف ، لأن تدمير الزغابات سيؤدي إلى إطلاق وسطاء يمكنهم تغيير نشاط العصب الوارد.
8. حدد الجزء لقياس نشاط العصب الوارد (على سبيل المثال ، الجزء الصائم الأول بعيدا عن رباط Treitz أو ثني الاثني عشر الصائمي) ، وضعه في غرفة تسجيل مصممة لهذا الغرض ومغلفة بطبقة من المطاط الصناعي من السيليكون.
   ملاحظه: يتم تعريف بداية الصائم تشريحيا على أنها جزء من الأمعاء الدقيقة حيث يعبر رباط تريتز الأمعاء الدقيقة ، ويسمى أيضا ثني الاثني عشر الصائمي.
   ملاحظه: قم بتغطية الجزء السفلي من غرفة التسجيل بطبقة رقيقة من المطاط الصناعي من السيليكون قبل بدء التجربة بوقت طويل. قم بإعداد طبقة المطاط الصناعي هذه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قم
9. بتفريد الغرفة باستمرار بمحلول كريبس الدافئ المكربن بمعدل 10 مل / دقيقة وحافظ على درجة حرارة كريبس في غرفة التسجيل ثابتة عند 34 درجة مئوية.
10. قم بتركيب الجزء الصائمي في حمام الأعضاء بحيث يتم توصيل الطرف الفموي بسائق المحقنة الذي يوفر تدفقا لموعيا ، ويتصل الطرف الفموي بالتدفق الخارجي. قم بتمديد الجزء قليلا ولكن احرص على عدم ممارسة التوتر المفرط. قم بتوصيل كلا الطرفين بإحكام باستخدام أربطة حريرية 4/0 بمنافذ التدفق الداخلي والخارج.
11. قم بتوصيل سائق المحقنة بالطرف الفموي ، وقم ببث الجزء الصائمي داخل اللمعة بمحلول كريبس (غير مؤكسج ، درجة الحرارة المحيطة) بمعدل 10 مل / ساعة.
12. استخدم دبابيس الحشرات لتثبيت المساريق في الجزء المعوي المركب بشكل مسطح على الطبقة السفلية من المطاط الصناعي السيليكوني. قم بتمديد المساريق لتحسين تصور حزمة المساريق. لا تمارس ضغطا على الحزمة أو الصائم.
13. قم بإجراء اختبار انتفاخ منحدر (بالفيديو تحت التحتية) عن طريق إغلاق منفذ الإخراج حتى يصل الضغط داخل اللمعة للجزء المعوي إلى 60 مم زئبق للتحقق من عدم تسرب محلول كريبس داخل اللمعة من الجزء المركب. لاحظ ارتفاعا سلسا في الضغط داخل اللمعة دون انقطاع.
14. لاحظ تقلصات صغيرة للجزء (الموجات التمعجية) خلال مرحلة الانتفاخ الأولية. إذا لزم الأمر ، قم بمنع النشاط التمعجي عن طريق إضافة 1 ميكرومتر من حاصرات قنوات الكالسيوم من النوع L nifedipine إلى محلول Krebs.
    ملاحظه: ستؤدي إضافة 1 ميكرومتر من الأتروبين إلى محلول كريبس بالإضافة إلى النيفيديبين إلى شل الجزء المعوي تماما.
15. تحت المجهر المجسم ، ابدأ برفق في تقشير الأنسجة الدهنية من المساريق عن طريق سحبها برفق باستخدام ملاقط صغيرين ، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية والأعصاب الواردة المدفونة في الأنسجة الدهنية.
16. ابدأ من مسافة بعيدة من الصائم ، وكشف كلا الأوعية الدموية في حزمة المساريق.
17. لاحظ العصب الصائم الوارد بين كلا الوعاءين بخيط أبيض رفيع مغلف في الأنسجة الدهنية. قم فقط بتشريح الصائم بشكل قريب من الصائم عن طريق تقشير الأنسجة الدهنية برفق باستخدام الملقط عندما يكون التحديد الأولي لكل من الأوعية المساريقية و / أو العصب الوارد صعبا.
18. تشريح العصب الصائم الصائمي للجزء مجانا على مسافة عدة ملليمترات ، عن طريق إزالة الأنسجة الدهنية الملتصقة بالعصب.
قم
19. بتمرير العصب باستخدام مقص الأنسجة الحاد. إذا لزم الأمر ، قم بتقشير الدهون المتبقية والأنسجة الضامة ، وكذلك غمد الخلايا العصبية ، عن طريق سحبها برفق باستخدام الملقط الصغير.
20. باستخدام معالج دقيق ، قم بخفض طرف قطب الشفط ، المتصل بحقنة مع مكبس ، في حمام الأعضاء ؛ ثم ، عن طريق التلاعب بالمكبس ، قم بشفط بعض محلول كريبس برفق من حمام الأعضاء بحيث يتم غمر طرف القطب في محلول كريبس (الشكل 1). تأكد من أن محلول كريبس يغطي قطب السلك داخل قطب الشفط.
    ملاحظه: استخدم مجتذب الماصة لتحضير الشعيرات الدموية لشفط زجاج البورسليكات التي تحتوي على قطب السلك قبل بدء التجربة.
21. ضع طرف قطب الشفط مباشرة بجوار خيط العصب الوارد المتقاطع واسحب الخيط العصبي المتقاطع في الشعيرات الدموية على طولها بالكامل.
22. قم بمناورة طرف القطب الكهربائي باتجاه بعض الأنسجة الدهنية واستنشاقها في الشعيرات الدموية الزجاجية أثناء الشفط بقوة باستخدام المكبس ، وبالتالي "إغلاق" العصب الموجود في الشعيرات الدموية ميكانيكيا من محتويات حمام الأعضاء.
23. تحقق من تسجيل نشاط العصب الوارد باستخدام نظام الحصول على البيانات ، على سبيل المثال ، عن طريق إجراء زيادة ناتجة عن انتفاخ المنحدر في إطلاق النار الوارد (بالفيديو). بعد عزل العصب في قطب الشفط ، قم بتثبيت التحضير لمدة 15 دقيقة من أجل الحصول على حالة ثابتة من نشاط العصب الوارد التلقائي قبل إجراء التجارب الفعلية.
24. لإجراء انتفاخ المنحدر ، قم بتوسيع الجزء المعوي عن طريق إغلاق منفذ الإخراج ، مما يؤدي إلى ارتفاع تدريجي في الضغط (حتى 60 مم زئبق). قم بتنفيذ البروتوكول التجريبي المطلوب فقط عندما ينتج عن ثلاثة انتفاخات منحدرة متتالية (بفاصل زمني مدته 15 دقيقة) تفريغا متعدد الوحدات قابلا للتكرار (الشكل 2).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على غرفة التسجيل المصممة لهذا الغرض وقطب الشفط. نظرة عامة مفصلة على الإعداد الفني مع وجود قطب الشفط وغرفة التسجيل في مكانها.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: التتبع التمثيلي للتسجيل في المختبر لنشاط العصب الصائمي. التسجيل النم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) كيماويات VWR 2,78,10,295 مركب حل كريبس كلوريد البوتاسيوم (KCl) أكروس أورجانكس 196770010 مركب حل كريبس فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH2PO4) كيماويات VWR 1,06,34,61,000 مركب حل كريبس بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ميرك 1,06,32,91,000 مركب حل كريبس كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) ميرك 1,05,88,61,000 مركب حل كريبس كلوريد الكالسيوم (CaCl2) ميرك 2,38,11,000 مركب حل كريبس د-الجلوكوز كيماويات VWR 1011175 ف مركب حل كريبس ماء مقطر مركب حل كريبس أنابيب PVC مستلزمات المختبرات العلمية يجب تركيب الجزء المعوي فوق أنابيب PVC أنابيب سيليكون مستلزمات المختبرات العلمية بقية الأنابيب ، تعتمد بشكل مثالي على السيليكون - إزاحة الحطام في الأنبوب بسهولة أكبر خيط الحرير بيرسال المحدودة 10 ب 15 إس 220 إرفاق الجزء فوق الأنابيب البلاستيكية سائق حقنة جهاز هارفارد 55-2222 التسريب داخل اللمعة من كريبس مجهر - بما في ذلك تكبير 10x في العين زايس ستيمي 2000 التصور الأمثل لتشريح العصب الوارد وحدة التحكم في البطانية الرئيسيةالحرارة جهاز هارفارد 507214 تسخين حجرة الأعضاء حمام عضو مخصص مع قاع مغطى ب Sylgard برنامج Spike2 تسجيل وتحليل البيانات دبابيس حشرات، 500 قطعة، ستانلس ستيل، قطر 0.2 مم دبابيس الحشرات Austerlitz minutiens تشريح العصب الوارد ملاقط دومون # 5 إينوكس 11 سم أداة الدقة العالمية 500341 تشريح العصب الوارد مقص زنبركي 14 سم أداة الدقة العالمية 15905 تشريح العصب الوارد قاعدة البيانات الرقمية NL 108T2 / 10 محول الضغط معالج دقيق ناريشيجي م -3333 التلاعب ثلاثي الأبعاد بقطب الشفط معالج دقيق كتلة دوارة X-4 التلاعب ثلاثي الأبعاد بقطب الشفط معالج دقيق حامل مغناطيسي GJ-8 التلاعب ثلاثي الأبعاد بقطب الشفط مصدر الضوء مجاهر يورومكس هولندا EK-1 التصور الأمثل لتشريح العصب الوارد CED 1401 جهاز التسجيل تسجيل نشاط العصب الوارد مزيل الضوضاء Humbug 50/60Hz أدوات البحث العلمي القضاء على ضوضاء الخلفية مضخة التسريب جيبسون مينيبولس 2 ضخ حجرة العضو التي يتم تركيب الجزء فيها حامل القطب الكهربائي الدقيق نصف الخلايا 1.5 مم أداة الدقة العالمية MEH2SW قطب شفط لعزل الألياف الواردة الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ، 300 جهاز كمبيوتر ؛ 1.5 / 0.84 OD / ID أداة الدقة العالمية 1ب 150-4 الشعيرات الدموية لعزل العصب الوارد