$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. إعداد الحل
- تحضير محلول خارج الخلية S1: 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثان سلفونيك (HEPES) محلول خارج الخلية المخزن يحتوي على (بالملليمتر) 145 كلوريد الصوديوم ، 5 كيلولوسيلتر ، 1 كلوريد الكالسيوم2 ، 1 ملغ كلوريد2 ، 10 هيبيس ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 (معدل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم) ؛ الأسمولية = 300 مللي أسم (معدلة بالجلوكوز).
- تحضير محلول خارج الخلية S2: محلول خارج الخلية يحتوي على محلول خارج الخلية (بالملليمتر) 125 كلوريد الصوديوم ، 25 NaHCO3 ، 5 KCl ، 1 CaCl2 ، 1 MgSO4 ، 5 مكرر (2-هيدروكسي إيثيل) -2-حمض أمينوإيثان سلفونيك (BES) ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 ؛ الأسمولية = 300 مللي أسمول (معدلة بالجلوكوز).
- تحضير محلول الاغاروز بدرجة حرارة منخفضة التبلور بنسبة 4٪ (S3) لتضمين الأنسجة: 4٪ درجة حرارة تبلور منخفضة. قم بإذابة 2 جم من الاغاروز منخفض التبلور في 50 مل من S1 في زجاجة مختبر زجاجية سعة 100 مل مع محرك مغناطيسي. لإذابة الاغاروز ، ضع الزجاجة في حمام مائي (مع غطاء غير مغلق بإحكام) عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا أو حتى يصبح المحلول شفافا أثناء التحريك. تبرد واحتفظ بالأغاروز المذاب في حمام مائي ثان عند 42 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
- تحضير محلول داخل الخلايا S4: محلول ماصة يحتوي على (بالملليمتر) 143 كيلو كلوسوم ، 2 كيلو أوهد ، 1 حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين جلايكول (EGTA) ، 0.3 كلوريدالكالسيوم 2 (حرCa 2+ = 110 نانومتر) ، 10 هيبس ، 2 ملح المغنيسيوم الأدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات (MgATP) ، 1 ملح الصوديوم 5′-ثلاثي الفوسفات (NaGTP) ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.1 (معدل باستخدام KOH) ؛ الأسمولية = 290 مللي أسم.
- تعديل / ضبط تكوين S1 و S2 و S4 وفقا للتصميم التجريبي الفردي (على سبيل المثال ، الحاصرات الدوائية لعزل أنواع معينة من التيارات التي يتم تنشيطها بالجهد).
2. تشريح VNO وتضمينه
- التضحية بالحيوان عن طريق التعرض لفترة وجيزة لثاني أكسيد الكربون2 وقطع الرأس باستخدام مقص جراحي حاد. ملاحظة: نظرا لأن الوقت من التضحية بالحيوان إلى وضع كبسولة VNO على الجليد أمر بالغ الأهمية ، قلل الوقت إلى أقل من دقيقتين. للحفاظ على صلاحية الأنسجة ، قم بتضمين كل من VNOs التي تم تشريحها بالكامل في الاغاروز في أقل من 30 دقيقة.
- قم بإزالة الفك السفلي بمقص جراحي كبير. ادخل من خلال تجويف الفم واقطع عظام الفك السفلي والعضلات لكل جانب على حدة.
- ضع الجزء المتبقي من الرأس رأسا على عقب في طبق بتري الكبير.
- اسحب جلد الفك العلوي وحول طرف الأنف باستخدام ملقط متوسط للوصول بشكل أفضل إلى القواطع.
- استخدم مقص العظام لقطع الجزء الأكبر من القواطع بزاوية ~ 45 درجة في الاتجاه المنقاري (الشكل 1 أ). سيسهل ذلك إزالة كبسولة VNO من تجويف الأنف.
ملاحظه: لا تقطع جذر السن لمنع تلف طرف كبسولة VNO.
- أمسك الحنك العلوي الصلب في الجزء المنقاري بملقط متوسط وقشره بعناية في قطعة واحدة بزاوية مسطحة (الشكل 1 ب).
ملاحظه: اشطفها مرارا وتكرارا باستخدام S2 المثلج.
- استخدم مقص زنبركي صغير لقطع الاندماج العظمي بين طرف عظم الفك والفك. أدخل أطراف المقص مع توجيه الجزء المنحني من الطرف إلى الخارج بعيدا عن VNO وقم بقص العظم بعناية في خطوات صغيرة على كل من الجانب الأيسر والأيمن الجانبي الجانبي لكبسولة VNO.
- لإزالة كبسولة VNO ، استخدم مقص زنبركي صغير لقطع عظم الفومر في الجزء الذيلي ورفع عظم الفومر بعناية من تجويف الأنف باستخدام ملقط متوسط. انقل VNO على الفور إلى طبق بتري صغير تحت مجهر استريو على عبوة هلام ثلج حيث سيتم تنفيذ الخطوات المتبقية من التشريح.
- اشطف VNO بكمية صغيرة من الثلج S2 لمنع الأنسجة من الجفاف.
- افصل الكبسولات الغضروفية التي تحتوي على الأنسجة الرخوة VNO عن طريق الإمساك بالجزء الخلفي من عظم الفومر ملقط متوسط. ضع الكبسولة للحصول على عرض ظهري بحيث يصبح الانقسام بين كلا VNOs مرئيا (الشكل 1Di).
- استخدم طرف الملقط الدقيق لفصل كبسولات VNO الغضروفي عن العظم المركزي مع الحفاظ على عظم الفومر مثبتا في الجزء الخلفي.
ملاحظه: استخدم الملقط فقط عند حافة كبسولة الغضروف واحرص على عدم اختراق الغضروف لأن الظهارة الحسية الحساسة تتلف بسهولة.
- بمجرد فصل VNOs ، ابدأ في إزالة الغضروف الذي يغلف VNO الأول.
- أمسك الحافة العلوية للكبسولة بملقط واحد ناعم وقم بتقسيم جدار الغضروف الذي كان متصلا سابقا بعظم الفومر (الجانب الإنسي).
- لإزالة الغضروف المتبقي ، اقلب VNO بجانبه الجانبي المنحني إلى قاع الطبق وقم بتثبيت الغضروف بإحكام على جانب واحد باستخدام الملقط. حرك الملقط الدقيق الثاني بعناية من الجانب الخلفي بزاوية مسطحة جدا بين الغضروف و VNO لتخفيف الاتصال بين الأنسجة والغضاريف.
- قشر VNO ببطء بعيدا عن الغضروف عن طريق تثبيته عند طرفه الذيلي، لتجنب إتلاف الظهارة الحسية.
- بمجرد رفع VNO من الكبسولة ، تأكد من إزالة جميع أجزاء الغضروف الصغيرة المتبقية لأن أي قطع متبقية من الغضروف ستفصل الأنسجة عن الاغاروز المحيط أثناء عملية التقطيع.
- ضع قطرة صغيرة من S2 المثلج على أول VNO تم تشريحه لمنع تلف الأنسجة. سيصبح وعاء دموي كبير على الجانب الجانبي مرئيا مما يشير إلى أن العضو لا يزال سليما ولم يتضرر بشكل جسيم أثناء التشريح (الشكل 2 أثانيا). في حالة تلف الأوعية الدموية ، سيظل من المفيد الاستمرار في تقطيع VNO طالما لم يكن التشكل العام ضعيفا بشكل واضح.
قم - بتشريح VNO الثاني على الفور.
- لتضمين VNOs ، املأ كلا من أطباق بتري الصغيرة على الحافة ب S3 الذائبة (مخزنة في حمام مائي عند 42 درجة مئوية ؛ انظر 1.3).
- أمسك VNO على الطرف الذيلي الأوسع باستخدام ملقط دقيق لتجنب تلف الظهارة الحسية.
- اغمر VNO في الاغاروز وحركه أفقيا ذهابا وإيابا عدة مرات لإزالة فيلم المحلول خارج الخلية وكذلك أي فقاعات هواء من سطحه.
- ضع VNO عموديا بحيث يكون الطرف الذيلي مواجها لقاع الطبق. بدلا من الضغط على VNO بالملقط مباشرة ، اضبط الاتجاه عن طريق تحريك طرف الملقط على مقربة من VNO.
ملاحظه: يعد التوجيه أثناء التضمين أمرا بالغ الأهمية لأنه يحدد مستوى الشريحة وإمكانية الوصول إلى الخلايا العصبية الحسية أثناء التجربة.
- ضع الأطباق على كيس ثلج جل وانتظر حتى يتجمد الاغاروز.
ملاحظة: لا تقم بتغيير اتجاه VNO بمجرد أن يبدأ الاغاروز في التصلب لأن هذا سيفصل الأنسجة عن الاغاروز المحيط.
فئة
3. تقطيع الأنسجة الإكليلية VNO
- استخدم ملعقة صغيرة لإزالة كتلة الاغاروز من الطبق الصغير في غطاء طبق بتري كبير ، واقلب الاغاروز رأسا على عقب مع ترك الطرف الذيلي ل VNO متجها لأعلى.
- قطع الكتلة إلى شكل هرمي باستخدام مشرط جراحي (3-4 مم عند الحافة ، 8-10 مم في الأسفل). احرص على عدم إتلاف الأنسجة المضمنة.
- استخدم الغراء الفائق لتثبيت الكتلة على شكل هرم في وسط لوحة عينة الاهتزاز وانتظر ~ 1 دقيقة حتى يجف الغراء تماما.
- انقل لوحة العينة إلى غرفة التقطيع وقم بإعداد VNO الثاني وفقا لذلك. احتفظ بالطبق مع العينة الثانية عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- استخدم ميكروتوم الشفرة الاهتزازية بالإعدادات التالية: السماكة: 150-200 ميكرومتر ؛ السرعة: 3.5 a.u. = 0.15 مم / ثانية ؛ التردد: 7.5 a.u. = 75 هرتز. انقل الشرائح إلى غرفة الأكسجين حتى الاستخدام بعد فحص مورفولوجيا الشريحة لفترة وجيزة تحت مجهر التشريح. يمكن الاحتفاظ بالشرائح لعدة ساعات.
< p class = "jove_title" >
4. تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الخلية
- بالنسبة للتسجيلات ، استخدم مجهرا مستقيما ثابتا مزودا بأهداف الغمر في الماء ، وتباين التداخل التفاضلي Dodt أو الأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) ، والتألق السطحي بالإضافة إلى كاميرا الجهاز المقترن بالشحن المبرد (CCD). للحصول على البيانات ، استخدم مضخم صوت مشبك التصحيح ، ومرحلة الرأس ، ولوحة واجهة تناظرية إلى رقمية / رقمية إلى تناظرية (AD / DA) وجهاز كمبيوتر (بما في ذلك برنامج التسجيل).
- قم بإعداد مخزون من 10-20 ماصة رقعة (4-7 MΩ). اسحب الماصات من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (القطر الخارجي 1.50 مم [OD]/القطر الداخلي 0.86 مم [ID]) باستخدام مجتذب ماصة دقيقة وتلميع للحريق باستخدام معبر microforge.
ملاحظه: يعد تلميع أطراف الماصة بالحريق أمرا بالغ الأهمية عند ترقيع شبكات VSN الصغيرة نوعا ما. سيساعد ذلك على منع تمزق غشاء الخلية عند الضغط السلبي من أجل الحصول على ختم عالي المقاومة. بعد تلميع فتحة الماصة يجب أن تكون حوالي 1 ميكرومتر.
- احتفظ بالماصات في وعاء تخزين الماصة لمنع التلف وتراكم الغبار حتى الاستخدام.
- إعداد نظام التروية عن طريق ملء خزانات المحلول والأنابيب وفقا للتصميم التجريبي.
ملاحظه: قم بإزالة فقاعات الهواء من الأنابيب تماما لأنها ستتداخل بشدة مع التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.
- اضبط الضغط لتحقيق ~ 3 مل / دقيقة تدفق.
ملاحظه: ستؤدي الضغوط العالية إلى حركة شريحة الأنسجة بالإضافة إلى إنهاء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.
- انقل شريحة VNO إلى غرفة التصوير وقم بإصلاح موضع الشريحة باستخدام مرساة من الفولاذ المقاوم للصدأ سلكية بألياف تركيبية بسمك 0.1 مم (الشكل 2B-C).
ملاحظه: لا تقم بتغطية شريحة الأنسجة بأحد خيوط الألياف الاصطناعية ، بل بالأحرى الاغاروز المحيط بالشريحة.
- انقل غرفة التصوير إلى إعداد التسجيل وقم بعمل شريحة فائقة الصمامات باستمرار مع S2 المؤكسج في درجة حرارة الغرفة عبر تطبيق الحمام.
- اضبط الشعيرات الدموية للشفط على سطح المحلول لإنشاء شفط بطيء للتبادل المستمر لمحلول الحمام. اضبط "قلم التروية" متعدد الأسطوانات 8 في 1 أعلى وبالقرب من الجزء غير الحسي من شريحة VNO التي تحتوي على الأوعية الدموية (الشكل 2 ج ، 3 أ). سيكون من المفيد ترتيب قلم رصاص التروية وماصة التسجيل لمواجهة الشريحة من اتجاهين متعاكسين.
- قم بتوصيل القطب المرجعي ومحلول الحمام باستخدام جسر أجار على شكل حرف L (مملوء ب 150 ملي مولار KCl).
- املأ ماصة التصحيح بمحلول الماصة S4.
- قم بتركيب الماصة فوق قطب التصحيح المطلي بكلوريد الفضة المتصل بمرحلة الرأس دون كشط الطلاء وإرفاقه بإحكام.
- ضع ضغطا إيجابيا طفيفا (حوالي 1 مل على حقنة بلاستيكية سعة 10 مل) على ماصة الرقعة قبل دخول الحمام.
- اخفض الماصة في الحمام باستخدام معالجات دقيقة بعيدا بما يكفي لتتمكن من غمر الهدف دون اصطدامه (الشكل 2 د).
- مراقبة مقاومة الماصة (R pip، بين 4-7 MΩ) باستخدام برنامج الفيزيولوجيا الكهربية المتصل بمرحلة الرأس.
ملاحظه: إذا كانتنقطة R <4 MΩ ، كسر الطرف الزجاجي. إذا كانت النقطة R >10 MΩ ، فمن المرجح أن يكون الطرف مسدودا ويجب استبدال الماصة.
- تصور شريحة VNO باستخدام كاميرا CCD باستخدام تباين التداخل التفاضلي المحسن بالأشعة تحت الحمراء (DIC) وتحديد FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: التسلسل المرتبط بمستقبلات ببتيد الفورميل 3) التي تعبر عن الخلايا (أو الخلايا العصبية المسماة بالمثل) باستخدام إضاءة التألق ومكعب مرشح مناسب.
- التركيز واستهداف الخلايا الفلورية أو غير الفلورية اعتمادا على التصميم التجريبي.
- للاقتراب من جسم الخلية ، استخدم العجلات اليدوية لتحقيق أقصى قدر من الحساسية. بسبب الضغط الإيجابي ، يصبح انبعاج صغير في غشاء سوما الخلية مرئيا بمجرد أن يكون طرف الماصة على مقربة.
- حرر ضغطا إيجابيا وقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف لامتصاص غشاء الخلية من أجل الحصول على ختم عالي المقاومة (1-20 GΩ). قم بتطبيق شفط قصير ولطيف لتعطيل غشاء الخلية وإنشاء تكوين الخلية بأكملها.
- مراقبة مقاومة الوصول باستمرار أثناء التجربة.
ملاحظه: قم فقط بتضمين الخلايا العصبية التي تظهر مقاومة وصول صغيرة ومستقرة (≤3٪ منمدخلات R ؛ تغيير <20٪ على مدار التجربة) في التحليل.
