التحقيق في الاستجابات العصبية السمعية في الفأر المستيقظ في وجود مانع للناقل العصبي المثبط

الملخص

المصدر: Ayala, Y. A., et al. تسجيل خارج الخلية للنشاط العصبي جنبا إلى جنب مع التطبيق الدقيق للمواد النشطة عصبيا في الفئران المستيقظة. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو دراسة النشاط العصبي في منطقة معينة من دماغ الفأر تعالج المحفزات السمعية. تتضمن هذه التقنية تطبيق مانع للانتقال العصبي المثبط ومقارنة الاستجابات العصبية بالمحفزات السمعية قبل وبعد تطبيق الدواء على منطقة الدماغ الموضعية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. أدوية الرحلان الأيوني المجهري

ملاحظة: يجب أن يكون للأدوية المستخدمة في الرحلان الجزئي شحنة كهربائية عند إذابتها في الماء. تحقق من الأدبيات لمعرفة ما إذا كان الدواء المعني مناسبا لهذا الإجراء. هنا ، يتم وصف إجراء الجابازين ، وهو مضاد لمستقبلات GABA_A.

1. قم بتصفية الماء المقطر باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرومتر لتعقيمه والتأكد من عدم احتوائه على مواد مذابة. باستخدام هذا الماء المقطر ، قم بإعداد ~ 1,000 ميكرولتر من 20 ملي مولار من الجابازين.
2. اضبط درجة الحموضة في التخفيف إلى 4 باستخدام 0.2 ميكرومتر من هيدروكسيد الصوديوم المفلتر باستخدام قطب الأس الهيدروجيني ذي الطرف الدقيق.
3. قم بتخزين 100 - 200 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج في يوم التسجيل. في ذلك اليوم ، قبل تقييد ، املأ البراميل (3-5 ميكرولتر) من القطب متعدد الماسورات بالأدوية ، باستخدام حقنة دقيقة سعة 100 ميكرولتر مزودة بإبرة بلاستيكية مرنة.

< p class = "jove_title" >2. الجراحة وزرع عمود الرأس

1. قم بإجراء تجارب على اثنين من ذكور فئران CBA / J (Mus musculus) بأوزان 27 و 30 جم.
2. في الأيام التي تسبق الجراحة ، تعامل مع واسمح لها بالاستكشاف بحرية في غرفة التسجيل لتعويدها عليها. قم بإجراء ثلاث جلسات يوميا ، تستغرق كل منها 30 دقيقة على الأقل. سيؤدي ذلك إلى تهدئتهم وجعلهم مرتاحين أثناء التسجيلات.
3. تخدير الفأر باستخدام مزيج من الكيتامين (50 ملغم/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ) المحقون في العضل. هذه الجرعة تخدير بعمق لمدة 1 ساعة تقريبا. إعطاء جرعات تكميلية من ثلث الجرعة الأولية حسب الحاجة.
4. ضع على بطانية تدفئة مثبتة للحفاظ على درجة حرارة 38 ± 1 درجة مئوية وتثبيت رأس في إطار تجسيمي باستخدام قضيبين للأذن وقضيب لدغة. احرص على عدم اختراق الغشاء الطبلي بقضبان الأذن.
5. احم العينين عن طريق وضع قطرة من جل العيون.
6. احلق فروة الرأس باستخدام المقص واستخدم بوفيدون اليود لتطهير الجلد.
7. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق على طول خط الوسط لكشف الجمجمة وسحب السمحاق الذي يغطي الجزء الجداري والجزء المنقاري من العظام القذالية.
8. قم بلصق عمود رأس دورالومين خفيف الوزن (الوزن ~ 0.65 جم ، الطول 30 مم ، الشكل 1 أ) بقاعدة مستديرة ومسطحة (قطر 5 مم) على الجمجمة. ألصق سلكا فضيا في منتصف عمود الرأس ، واترك نهاياته خالية. سيتم استخدام السلك الفضي كقطب مرجعي للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي.
9. ضع طبقة رقيقة من المادة اللاصقة القابلة للعلاج بالضوء على الجمجمة وقاعدة عمود الرأس. انتظر 10 ثوان وضع عمود الرأس فوق المنطقة المنقارية للعظام الجداري ، على طول خط الوسط.
قم
10. بمعالجة المادة اللاصقة بالضوء باستخدام مصدر الضوء الأزرق لمدة 20 ثانية للحصول على قوة ربط فعالة.
11. قم بحفر ثلاثة ثقوب حول وخلف قاعدة العمود الأمامي باستخدام مثقاب كهربائي ومثقاب صغير.
12. ضع براغي ساعة (بطول ~ 2 مم) في الثقوب المحفورة لتكون بمثابة نقاط اتصال إضافية بين الجمجمة ومنصة الرأس. تتطلب البراغي 11/2 لفات لتحقيق ملاءمة مريحة. اختبر البراغي بالملقط للتأكد من أنها ليست مفكوكة.
13. أدخل طرف السلك الأرضي الفضي في الفتحة الثالثة ، مع التأكد من ملامسته للجافية. ضع قطرة صغيرة من غراء سيانواكريليت المقاوم للماء لربط السلك بالجمجمة.
14. ضع مركب معالج بالضوء لتعزيز رابطة عمود الرأس بالجمجمة. قم بتغطية قاعدة العمود الأمامي والجزء السفلي من السلك الفضي والبراغي ، مع الحرص على عدم التمدد خلف lambda للسماح بالوصول أثناء التسجيل. عالج باستخدام مصدر الضوء الأزرق.
15. اسحب العضلة الموجودة في مؤخرة الرقبة بالقرب من إدخالها على الجمجمة. باستخدام تريفين صغير (قطر 2.35 مم) ، قم بحفر نافذة مستديرة أسفل خياطة لامدا مباشرة وجانبية لخط الوسط ، لفضح القولون السفلي (IC). اسحب عظم التغطية بملاقط دقيقة عندما تكون الحدود فضفاضة. في حالة حدوث نزيف ، اشطفه بمحلول ملحي معقم بارد لإيقافه.
16. استخدم المركب لعمل جدار صغير (~ 1 مم بعرض وارتفاع ~ 1 مم) حول النافذة ومعالجته بالضوء.
17. قم بتغطية الجمجمة والعضلات المكشوفة بمرهم مضاد حيوي. بعد ذلك ، قم بترطيب السطح المكشوف للجهاز المكشوف بمحلول ملحي معقم وقم بتغطيته بالفازلين ، واملأ البئر المتولد بعد عمل الجدار حول نافذة التسجيل.
18. حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.03 ملغم/كغ، مخفف بنسبة 1:10 في محلول ملحي معقم) كمسكن.
19. احتفظ بالحيوان على بطانية التدفئة حتى يستيقظ وأعده إلى قفص السكن الخاص به للتعافي من الجراحة لمدة ثلاثة أيام قبل جلسات التسجيل. المنزلية في قفص سكن الفئران الفردية لمنع زملائها في القفص من تنظيف الهلام وعمود الرأس الذي يلامس غطاء الشبكة المعدنية. ضع بعض التخصيب في القفص عندما يكون في منزل واحد. أيضا ، قم بتغيير نشارة الخشب يوميا لمنع العدوى وتحقق بعناية من تعافي بشكل صحيح ولا تظهر عليه أي علامات على عدم الراحة. تحقق أيضا مما إذا كان الفازلين فوق نافذة التسجيل التي تحمي الدماغ المكشوف.

< p class = "jove_title" >3. التسجيل الفيزيولوجي الكهربي والرحلان الأيوني الصغير

1. بعد التعافي ، امنح وقتا للتأقلم مع بيئة التسجيل وتقييد رأسه. تأقلم عن طريق تثبيت عمود الرأس على الحامل بينما يجلس الفأر على مصفاة رغوية مبطنة مصنوعة خصيصا منحوتة حسب حجم جسمه (الشكل 1 ب). سيؤدي ذلك إلى الحد من حركات الماوس وسيساهم في هدوئه.
2. ابدأ بجلسات مدتها 10 دقائق وقم بزيادة المدة تدريجيا حتى 120 دقيقة. خلال الجلسة ، كافئ بالسوائل الحلوة (حليب مكثف ، مخفف 30:70 في الماء) على فترات محددة. في وقت لاحق ، أثناء جلسة التسجيل ، امنح نفس المكافأة في بداية الجلسة وفي نهايتها أو أثناء عدم عزل أي خلية عصبية.
3. إذا كان متحمسا قبل التسجيل ، فقم بحقن الأسيبرومازين المهدئ الخفيف (2 مجم / كجم ، داخل الصفاق). وفقا للنظام العصبي محل الاهتمام ، يمكن أن يؤثر المهدئ على نتائجك.
4. دع يستكشف غرفة التسجيل بحرية لمدة 5 - 10 دقائق.
5. ضع جسم في مصفاة الرغوة المبطنة المصنوعة خصيصا (الشكل 1 ب).
6. قم بتأمين عمود الرأس بحامل متصل بالإطار التجسيمي (الشكل 1C). هذا هو الوقت المناسب لمنح مكافأة سائلة.
7. قم بتغطية جسم ببطانية قطنية واربطه بشكل غير محكم باستخدام نصف أسطوانة بلاستيكية وشريط لاصق.
8. أخرج الفازلين من نافذة التسجيل واشطفه بمحلول ملحي معقم دافئ.
9. تسجيل النشاط العصبي والتطبيق الأيوني للجابازين.
   1. ضع القطب الكهربائي متعدد الأسطوانات على حامله ، ويتم التحكم فيه بواسطة محرك أقراص صغير وتوصيله بمعالج دقيق.
   2. قم بتوصيل الأسلاك للتسجيل باستخدام مقاطع التمساح الصغيرة. قم بتوصيل الطرف الموجب بنهاية قطب التنغستن ، والطرف الأرضي بالسلك الفضي الذي يتصل بالجافية.
   3. ضع سلكا فضيا غير مطلي داخل كل برميل بحيث يتصل أحد طرفيه بالمحلول ويمكن الوصول إلى الطرف الآخر. قم بتوصيل هذه الأطراف بجهاز الرحلان الأيوني الصغير ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   4. حرك القطب الكهربائي متعدد الأسطوانات حتى يلامس الطرف سطح الدماغ. ضع محلول ملحي معقم دافئ لمنع جفاف أنسجة المخ. عند هذه النقطة ، قم بتطبيق تيار احتجاز (-10 نانو أمبير للجابازين ؛ تحقق من الأدبيات الخاصة بعقار معين) لتجنب تسرب الدواء من طرف البرميل أثناء البحث عن نشاط وحدة واحدة.
   5. استخدم التقنيات القياسية لعزل نشاط الخلايا العصبية المفردة خارج الخلية. احصل على منطقة استجابة التردد (FRA) للخلايا العصبية ، أي مزيج من الترددات والشدة القادرة على استحضار استجابة لأن الخلايا العصبية حساسة لهذه الأصوات.
   6. اختر ترددين (f1 و f2) يستحضران معدل إطلاق ونمط إطلاق مماثلين. قدم كل من هذه الترددات كمحفز نادر ومتكرر تحت نموذج غريب الأطوار.
      ملاحظه: باختصار ، في نموذج غريب الأطوار ، يتم تقديم تردد واحد (f1) على أنه الحافز المتكرر مع احتمال كبير للحدوث ، في حين أن الثاني (f2) هو المنبه المنحرف الذي نادرا ما يحدث ، ويتخلله بشكل عشوائي بين الترددات المتكررة. في تسلسل غريب الأطوار الثاني ، يتم عكس الاحتمالات النسبية للمحفزين.
   7. حرر الجابازين عن طريق تحويل التيار إلى قيم موجبة (10 - 20 نانو أمبير). احصل على FRA مرة أخرى وكرر نموذج غريب الأطوار تحت تطبيق الجابازين. حافظ على الطرد حتى يلاحظ تأثير مرئي في معدل إطلاق النار ؛ عادة ما يستغرق الأمر من 5 إلى 20 دقيقة ، اعتمادا على الدواء المعين وتركيزه وحجم تيار القذف. كرر بروتوكول التسجيل للحصول على القيم تحت تأثير الدواء.
   8. أوقف الحقن عن طريق إرجاع التيار إلى قيم الاستبقاء. انتظر حتى يغسل تأثير الدواء من خلال مراقبة ما إذا كان FRA أو الاستجابة لنموذج غريب الأطوار يعود إلى قيم التحكم.
      ملاحظه: يمكن أن تستمر جلسات التسجيل من 2 إلى 3 ساعات يوميا ويجب إنهاؤها في وقت مبكر إذا أظهر أي علامة على عدم الراحة أو المعاناة. امنح مكافأة سائلة وقم بتغطية غرفة التسجيل بالفازلين.

النتائج

الشكل 1. ملحقات لتسجيلات الفئران المستيقظة. (أ) عمود الرأس. (ب) مصفاة رغوية مبطنة حسب الطلب. ضع الماوس بين كلتا القطعتين ، واترك الرأس بالخارج. (ج) إدخال تعديلات على الإطار التجسيمي. يساعد حامل عمود الرأس (الشريط العلوي) أثناء زرع عمود الرأس ويقيد الرأس أثناء التسجيلات. يتم استخدام قطعة العض (الشريط السفلي) فقط أثناء زرع عمود الرأس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سلك التنغستن هارفارد للأجهزة المحدودة 33-0099 0.005 بوصة × 3 بوصات زجاج البورسليكات الشعري هارفارد للأجهزة المحدودة 30-0053 جدار قياسي من البورسليكات بدون خيوط ، 1.5 مم OD ، معرف 0.86 مم ، طول 100 مم الشعيرات الدموية الزجاجية متعددة الماسورين أدوات الدقة العالمية 5B120F-4 شعرية 5 أسطوانات ، بطول 4 بوصات ، OD 1.2 مم ، مع خيوط ديابلس ديادنت 2001-2101 لاصق للمعالجة بالضوء ، يستخدم لربط قطب التنغستن بماصة الزجاج متعددة الماسورات جي بوند شركة GC 2277 م لاصق معالج بالضوء ، يستخدم لربط عمود الرأس بجمجمة الكاريزما هيريوس كولزر 66000087 مركب معالجة الضوء ، يستخدم لتقوية رابطة عمود الرأس بالجمجمة أرالديت كريستال سيس إكسبوكسي مكون من 2 مكونات، يستخدم لزيادة تأمين ربط قطب التنغستن بالماصة الزجاجية متعددة الماسورات بطانية التدفئة سيبرتيك RTC1 إطار تجسيمي ناريشيجي ريال 6 نيوتن معدلة للفئران جهاز ميكرونتوفوريتيك هارفارد للأجهزة المحدودة نيوروفور BH-2 بما في ذلك مضخات الرحلان الأيوني IP-2 (واحدة لكل قناة توصيل الدواء) ووحدة توازن مجتذب ماصة زجاجية متعددة الماسورات ناريشيجي نموذج PE-21 مصباح LED تكنوفلوكس السيرة الذاتية -215 5 واط، 430-485 نانومتر ميكروفيل أدوات الدقة العالمية MF34G-5 إبرة بلاستيكية مرنة ، 34 AWG [إيملجن] ميريال كيتامين، 100 ملغم/مل رومبون باير زيلازين، 20 ملغم/مل الجابازين / SR-95531 سيغما S106 تحضير ~ 1000 ميكرولتر من 20 ملي مولار من الجابازين في الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني على 4