$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. الزراعة المشتركة للخلايا النجمية MN والحبل الشوكي في ألواح مصفوفة متعددة الأقطاب
الكهربائية
- قم بتمييز الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية ووضعها عندما تكون جاهزة للاستخدام في نفس اليوم وعمرها في المختبر (DIV) 60 للخلايا العصبية الحركية و DIV 90 للخلايا النجمية.
- قم بتغطية ألواح MEA في اليوم السابق أو في يوم الطلاء على النحو التالي إذا كنت تعمل بألواح بلاستيكية ذات 24 بئرا (جدول المواد).
- تمييع البولي أورنيثين (PLO) في الماء أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 100 ميكروغرام / مل.
- أضف 15-20 ميكرولتر إلى كل بئر (حسب مستوى راحة الماصة) ، لتشكيل قطرة في وسط البئر تغطي منطقة الأقطاب الكهربائية والمنطقة المحيطة بها ولكن ليس البئر بأكملها.
- احرص على عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة. كن متسقا مع الحجم من البئر إلى البئر لضمان تغطية نفس مساحة السطح في كل بئر.
- احتضان منظمة التحرير الفلسطينية عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة (يفضل ساعتين).
ملاحظه: سوف تجف الأحجام الصغيرة إذا لم تكن هناك رطوبة كافية في الألواح. أضف الماء إلى المقصورات المحيطة بالآبار لضمان الرطوبة الكافية طوال فترة الطلاء والتسجيلات.
- قم بشفط أكبر قدر ممكن من منظمة التحرير الفلسطينية باستخدام طرف ماصة بلاستيكية دقيقة. احرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية. يغسل ب 250 ميكرولتر من الماء ثلاث مرات. إذا كنت تستخدم شفاط فراغ للغسيل ، فلا تسمح للطرف بالقرب من مجموعة القطب. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء باستخدام طرف الماصة حسب الضرورة. دع السطح يجف تحت غطاء مزرعة الخلية مع إزالة الغطاء.
- بمجرد أن تجف أسطح الألواح ، أضف اللامينين المخفف إلى 10 ميكروغرام / مل في PBS. استخدم 15-20 ميكرولتر لتغطية كل مجموعة قطب. أضف الماء إلى حجرات الرطوبة ، واستبدل الغطاء ، وأعد اللوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعتين حتى ليلة وضحاها.
- في يوم الطلاء ، اشطف الخلايا العصبية الحركية (MN) ومزارع الخلايا النجمية مرة واحدة باستخدام PBS وأضف التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لرفع الخلايا (5 دقائق). اجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على مثبط التربسين واغسل الألواح ذات الوسط أو القاعدة لضمان جمع جميع الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقه باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لتوليد 1 مل من معلق خلية واحدة. عند إعادة تعليق MN والخلايا النجمية ، قم بالتبديل إلى وسط الزراعة المشتركة (الجدول 1) ، مع إضافة 20 ميكرومتر من الملف الملفوف المرتبط ب Rho لتشكيل مثبط بروتين سيرين / ثريونين كيناز (ROCK-I).
- عد MN والخلايا النجمية بالتوازي باستخدام مقياس كثافة الدم. أثناء العد وإجراء العمليات الحسابية ، قم بتغطية تعليق الخلية وضعها في رف الستايروفوم عند 4 درجات مئوية.
- احسب الحجم المطلوب لإعادة تعليق الثقافات إلى تركيز 5 × 104 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا العصبية الحركية و 2.5 × 104 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا النجمية. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية سعة 1 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقه في الحجم المحسوب.
- احسب عدد الآبار المرغوبة المراد زرعها واضربها في 5 ميكرولتر من كل معلق خلية. اجمع بين الحجم المطلوب من تعليق الخلايا العصبية والخلايا النجمية بنسبة 1: 1 واخلطها عن طريق سحب العينات حتى تمتزج تماما (عادة مرتين) ولكن تجنب أن تكون عدوانيا للغاية.
- قم بإزالة اللامينين من كل بئر من لوحة MEA باستخدام طرف ماصة. انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية المركب النهائي إلى كل بئر ، لتشكيل قطرة صغيرة تغطي مصفوفة الأقطاب الكهربائية لتوفير كثافة خلية تبلغ 5 × 104 MN و 2.5 × 104 خلايا نجمية لكل بئر.
ملاحظه: تتطلب كثافة الخلايا العالية في المعلق المركب إعادة تعليق متكررة بين الآبار أثناء خطوة البذر لضمان تعداد الخلايا الدقيق والمتسق.
- أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 20-30 دقيقة. احرص على عدم إزعاج قطرة الخلية والسماح للخلايا بتكوين مرفقات أولية على الألواح.
- بعد 20-30 دقيقة ، أضف وسائط الاستزراع المشترك الدافئة + ROCK-I إلى كل بئر عن طريق سحب 250 ميكرولتر لأسفل على جدار كل بئر ، متبوعا ب 250 ميكرولتر إضافي أسفل جدار نفس البئر على الجانب الآخر. أعد الطبق إلى الحاضنة.
- افحص الأطباق في اليوم التالي للبذر (يوم الزراعة المشتركة 1). إذا كان هناك بقايا خلوية كبيرة أو خلايا ميتة ، فاستبدل الوسط بوسط زراعة مشترك جديد يحتوي على ROCK-I. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسيط في اليوم الثاني بعد البذر (يوم الثقافة المشتركة 2) إلى وسط الزراعة المشتركة بدون ROCK-I. قم بإجراء عمليات تبادل نصف متوسطة (استنشق 50٪ وأضف 60٪ من الحجم النهائي لحساب التبخر) مرتين في الأسبوع.
- في حالة استخدام أنظمة MEA مع ألواح زجاجية مفردة بئر 30 مم (جدول المواد) ، قد يستغرق تحضير اللوحة يومين أو أكثر. اتبع الخطوات أدناه لتنفيذ ذلك.
- ارفع الخلايا وبقايا الخلايا من مزارع MEA السابقة باستخدام 0.05٪ تريبسين لمدة 5-15 دقيقة.
- شفط التربسين واشطفه ثلاث مرات بالماء.
- قم بالتعقيم بإضافة 70٪ من الإيثانول واحتضانه في الغطاء لمدة 10 دقائق.
- ضع منظفا أنيونيا بنسبة 1٪ مع إنزيم البروتياز في الماء. غطي الألواح بغطاء ولفيها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم ، ثم اتركيها على كرسي هزاز في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
- استنشق المنظف ، ثم اشطفه ثلاث مرات بالماء.
- إذا كنت تخطط لتخزين الأطباق ، أضف كمية كافية من الماء. غطي الأطباق بغطاء ولفيها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم واتركيها في الثلاجة حتى الاستخدام التالي.
- إذا كنت تخطط للطلاء ، اترك السطح يجف تحت غطاء مزرعة الخلايا.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تعقيم إضافي (على سبيل المثال ، عدوى سابقة أو استخدام غير حديث) ، في هذه المرحلة فقط ، قم بتعريض ألواح MEA للأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت غطاء المحرك لمدة 30-60 دقيقة
ملاحظه: تجنب الأشعة فوق البنفسجية المتكررة سيمنع تلف الأقطاب الكهربائية. سيؤدي استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية عندما تحتوي الألواح على مصل إلى أقطاب كهربائية غير وظيفية ، ولهذا السبب يجب استخدامه فقط على الألواح النظيفة.
- عندما تجف الألواح تماما ، استمر في تنظيف البلازما لمدة 1 دقيقة لشحن السطح الزجاجي لألواح MEA وتعزيز فعالية الطلاء. تنظيف البلازما مرة واحدة على الأقل كل 4-5 دورات من دورات تنظيف الألواح في الشرق الأوسط وأفريقيا.
- كبديل ، عندما يكون تنظيف البلازما غير ممكن أو غير مبرر ، أضف كمية كافية من الوسط المحتوي على مصل الأبقار الجنيني (FBS) لتغطية سطح ألواح MEA وإعادتها إلى الحاضنة طوال الليل.
- استخدم PLO (بولي أورنيثين) / طلاء Laminin. أضف محلول PLO (100 ميكروغرام في PBS) مباشرة بعد تنظيف البلازما أو شفط وشطف الوسط المحتوي على FBS.
- قم بوضع الخلايا على النحو الوارد أعلاه في الكثافات التالية: 1 × 105 الخلايا النجمية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hiPSC-A) / لوحة و 5 × 105 الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hiPSC-MN) / لوحة.
< p class = "jove_title" >
2. تسجيل مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية
- استخرج بيانات الجهد الخام بتردد أخذ العينات 12.5 كيلو هرتز ، باستخدام مرشح Butterworth مع تمرير عالي 200 هرتز ومرشح تمرير منخفض 3 كيلو هرتز. قم بتعيين التعرف على السنبلة كنقاط زمنية فورية للجهد ≥6 انحرافات معيارية عن خط الأساس. تحديد الرشقات النارية كنشاط مع >5 طفرات في 100 مللي ثانية. حدد نشاط الشبكة عندما يتم إطلاق أكثر من 35٪ من إجمالي الأقطاب الكهربائية النشطة في غضون 100 مللي ثانية بحد أدنى 50 ارتفاعا لكل انفجار في الشبكة.
- ابدأ التسجيل في أقرب وقت ممكن بعد يوم الثقافة المشتركة (CC) 1.
ملاحظه: نادرا ما يتم ملاحظة النشاط الكهربائي قبل CC Day 3.
- المزارع المتوازية للألواح بكثافات مماثلة وتتكرر في ألواح الاستزراع المناسبة أو أغطية المقايسات الكيميائية الحيوية أو الكيمياء المناعية (ICC) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
- قم بإجراء التسجيلات مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون2 عند 5٪. انقل اللوحات إلى الجهاز واسمح لها بالتوازن لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
- سجل نشاط خط الأساس إما كل يومين أو أسبوعيا ، على مدى 1-15 دقيقة حسب التصميم التجريبي. لا تسجل لمدة ساعة واحدة على الأقل بعد التبادل المتوسط ، ومن الناحية المثالية انتظر لمدة 24 ساعة بعد كل تبادل للوسائط.
- لمنع التلوث ، قم بتغيير الوسط (أي نصف التبادل المتوسط كما في الخطوة 1.14) بعد أي تسجيل يجب فيه فتح غطاء اللوحة المعقمة خارج الغطاء المعقم (أي تطبيق مركبات الدواء). قم بإجراء عمليات تبادل وغسيل متوسطة كاملة لغسل الأدوية إذا كان سيتم الاستمرار في استخدام الألواح بعد العلاج من تعاطي المخدرات.
- لأغراض التحليل ، استخدم ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات فنية وبيولوجية لكل حالة. عبر عن البيانات الفيزيولوجية الكهربية كوسيلة ل n ≥ 3 يتكرر.