تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. تشريح وعزل الشريان الدماغي
ملاحظة: تتطلب جميع إجراءات التشريح تكبير العينة (حتى 50x) عبر المجاهر المجسمة والإضاءة التي توفرها مصادر ضوء الألياف البصرية. لإجراء إجراءات التشريح لعزل الدماغ والشرايين ، استخدم أدوات تشريح حادة. تشتمل أدوات التشريح المجهري لعزل الشرايين وتنظيفها على ملقط حاد ذو رؤوس دقيقة ومقص تشريح على غرار Vannas (شفرات من 3 إلى 9.5 مم).
- عزل دماغ الفأر
- تخدير فأر C57BL / 6 (عمر 3-30 شهرا ؛ ذكر أو أنثى) عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (3٪ لمدة 2-3 دقائق) ، ثم قطع رأس مباشرة بعد الحث الكامل للتخدير. ضع الرأس في طبق بتري (قطر 10 سم ، عمق 1.5 سم) يحتوي على بارد (4 درجات مئوية) صفر Ca 2+ محلول ملح فسيولوجي (PSS) تحت مجهر مجسم.
- المشاهدة من خلال المجهر ، قم بإزالة الجلد والشعر فوق الجمجمة وإزالة الدم الزائد باستخدام الصفر البارد Ca 2 + PSS. قم بعمل شق باستخدام أطراف مقص التشريح القياسي فقط (على سبيل المثال ، شفرة 24 مم) ، بدءا من العظم القذالي ويمتد عبر عظم الأنف للجمجمة.
- افتح الجمجمة بعناية على طول الشق باستخدام ملقط خشن الرؤوس ، وافصل النسيج الضام لعزل الدماغ بدائرة ويليس سليمة.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ملقط قطع العظام Littauer لفتح الجمجمة وفضح الدماغ.
- اغسل الدماغ المعزول برفق باستخدام الصفر البارد Ca 2+ PSS في دورق لإزالة الدم. ضع الجانب البطني للدماغ متجها لأعلى في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين الدماغية ( الشكل 1 أ ).
- عزل الشرايين الدماغية
ملاحظة: تم اختيار الشريان الدماغي الخلفي كنموذج تمثيلي لدراسة البطانة الدماغية الوعائية لهذا البروتوكول.
- قم بتأمين الدماغ المعزول في محلول التشريح البارد باستخدام دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 0.2 مم ، طول ~ 11-12 مم) ليتم إدخالها في بوليمر السيليكون المملوء بالفحم الذي يغطي الجزء السفلي (العمق ≥50 سم) من طبق بتري زجاجي.
- للحفاظ على درجة حرارة مبردة من PSS أثناء التشريح ، استخدم غرفة تشريح مبردة بواسطة نظام تبريد باستمرار لتدوير خليط الماء والإيثيلين جلايكول 1: 1. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التشريح على الثلج الطازج.
- عزل الشرايين الدماغية الخلفية جراحيا (~ 0.3 إلى 0.5 سم ، أجزاء ، بدون توتر محوري) من الشرايين الخلفية والقاعدية باستخدام أدوات التشريح المجهري مقص Vannas Style والملقط الحاد ذو الرؤوس الدقيقة ( الشكل 1 ب ). استخدم دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 0.1 مم ، طول ~ 13-14 مم) لتأمين كل من الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة في محلول التشريح في طبق بتري ( الشكل 1C ).
- نظف الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة بعناية عن طريق إزالة النسيج الضام باستخدام ملقط حاد ذو رؤوس دقيقة ( الشكل 1D ). قطع الشرايين السليمة إلى شرائح (الطول 1-2 مم) للهضم الأنزيمي ( الشكل 1D ؛ داخلي).
2. تحضير الأنبوب البطاني والصخ الفائق
- قم بإعداد جهاز التريتوري باستخدام مجهر مجهز بأهداف (10x و 20x و 40x) وكاميرا ومرحلة من الألومنيوم تحتوي على غرفة ومعالجات دقيقة. قم بتأمين حقنة دقيقة باستخدام وحدة تحكم في المضخة المجاورة للمسرح والعينة ( الشكل 2 أ ).
- قم بإعادة ملء ماصة التخلي بالكامل بالزيت المعدني وثبتها فوق مكبس الحقنة الدقيقة. بعد ذلك، باستخدام المحقنة الدقيقة المزودة بوحدة التحكم في المضخة، اسحب محلول التفكك إلى الماصة (~130 نيولتر) أعلى الزيت المعدني مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء في الماصة.
- ضع الأجزاء الشريانية السليمة في 1 مل من محلول التفكك في أنبوب زجاجي سعة 10 مل ( الشكل 2 ب ) ، يحتوي على 0.31 مجم / مل غراء ، 0.5 مجم / مل ثنائي إريثريتول ، 0.75 مجم / مل كولاجيناز ، و 0.13 مجم / مل إيلاستاز. احتضن عند 34 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة للهضم الجزئي.
- بعد الهضم ، استبدل محلول الإنزيم ب ~ 5 مل من محلول التفكك الطازج. باستخدام ماصة سعة 1 مل، انقل جزءا واحدا إلى حجرة تحتوي على محلول التفكك في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ضع الماصة في محلول التفكك في الغرفة وضعها بالقرب من أحد طرفي الوعاء المهضوم. قم بتعيين معدل في نطاق 2 إلى 5 نانولتر / ثانية على وحدة التحكم في المضخة للتجربة اللطيفة ( الشكل 2C ؛ داخلي).
- أثناء المشاهدة من خلال تكبير 100x إلى 200x ، اسحب الجزء الشرياني وإخراجه لفصل خلايا العضلات الملساء أثناء إنتاج أنبوب بطاني. إذا لزم الأمر ، استخدم ملقطا رفيع الرؤوس بعناية لفصل adventitia المنفصل والصفيحة المرنة الداخلية عن الأنبوب البطاني. تأكد من أن جميع خلايا العضلات الملساء منفصلة وأن الخلايا البطانية فقط هي التي تبقى "أنبوب" سليمة ( الشكل 2C ).
- باستخدام أجهزة المعالجة الدقيقة ، قم بتأمين كل طرف من طرفي الأنبوب البطاني على زلة الغطاء الزجاجي لغرفة الانصهار الفائق باستخدام ماصات تثبيت زجاج البورسليكات ( الشكل 2D ).
- اغسل خلايا العضلات الملساء المنفصلة وخلايا العضلات الملساء من الغرفة واستبدل محلول التفكك ب 2 ملي مولار CaCl 2 PSS. انقل المنصة المتنقلة باستخدام أنبوب بطاني آمن إلى مجهر الصخ الفائق والحفارة التجريبية.
- استخدم 6 خزانات نظيفة سعة 50 مل ( الشكل 3 أ ) للتوصيل المستمر ل PSS والمحاليل الدوائية ذات الصلة أثناء التجربة ، حسب الاقتضاء. استخدم صمام التحكم في التدفق المضمن لضبط معدل التدفق يدويا طوال الوقت بما يتفق مع التدفق الرقائقي مع مطابقة تغذية التدفق مع شفط الفراغ. قم بتوصيل PSS إلى الغرفة ( الشكل 3 ب ) لعملية الاندماج الفائق للأنبوب البطاني لمدة 5 دقائق ≥ قبل تسجيل بيانات الخلفية وتحميل الصبغة.
3. تحميل الصبغة وإعدادات الغسيل ودرجة الحرارة
- قم بتشغيل جميع مكونات نظام القياس الضوئي لقياس [Ca2+]i. استخدم المجهر الموجود على الجهاز التجريبي ( الشكل 3C ) لعرض الأنبوب البطاني بتكبير 400x ، والتركيز على الخلايا في نافذة القياس الضوئي باستخدام مجموعة برامج نظام القياس الضوئي.
- قم بقياس قطر الأنبوب البطاني وسجل قيم التألق الذاتي في الخلفية بما يتفق مع انبعاث 510 نانومتر أثناء الإثارة البديلة عند 340 و 380 نانومتر (≥10 هرتز).
- لقياس استجابات Ca 2 + ([Ca 2 + ] i ) ، قم بتحميل الأنبوب البطاني بصبغة Fura-2 AM (إستر Fura-2-acetoxymethyl ، التركيز النهائي 10 ميكرومتر) عند RT والسماح ~ 30-40 دقيقة في حالة عدم وجود ضوء.
- أعد تشغيل التروجين الفائق للأنبوب البطاني باستخدام PSS جديد لمدة ~ 30-40 دقيقة لغسل الصبغة الزائدة والسماح ل Fura-2 AM داخل الخلايا بإزالة الأسترة. خلال فترة الغسيل ، ارفع درجة الحرارة تدريجيا من RT إلى 37 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة ( الشكل 3 أ ) مع سخان مضمن ، ثم حافظ على 37 درجة مئوية طوال التجربة.
ملاحظة: يستلزم الانتقال التدريجي الموصى به بين RT إلى 37 درجة مئوية ثلاث خطوات (على سبيل المثال ، 5 درجات مئوية) مع وقت توازن ≥5 دقائق في كل خطوة.
4. القياس المتزامن ل [Ca2+]i و Vm
- قم بتشغيل جميع المعدات الأخرى ومجموعة برامج المقياس الكهربائي لقياس إمكانات الغشاء (Vm, انظر الشكل 3, الشكل 4). اضبط معدل الحصول على البيانات وفقا لذلك (≥10 هرتز).
- اسحب قطبا كهربائيا حادا وردمها ب 2 متر KCl. لدراسات الاقتران بين الخلايا عن طريق نقل الصبغة ، قم بإعادة ملء الأقطاب الكهربائية الدقيقة بنسبة 0.1٪ من يوديد البروبيديوم المذاب في 2 M KCl.
- قم بتثبيت القطب الكهربائي فوق سلك فضي مطلي بالكلوريد في حامل الماصة المتصل بمرحلة رأس مقياس كهربية مؤمن بمعالج دقيق. استخدم المعالج الدقيق لوضع طرف القطب الكهربائي لفترة وجيزة في PSS المتدفق في الغرفة أثناء المشاهدة من خلال الهدف 4x.
- اضبط Vm على 0 بما يتوافق مع إمكانات الحمام المؤرض. ضع طرف القطب فوق خلية الأنبوب البطاني مباشرة. إذا رغبت في ذلك ، استخدم شاشات خط الأساس المسموعة المرتبطة بأجهزة القياس الكهربائي لربط درجة الصوت بالتسجيلات المحتملة.
- قم بزيادة التكبير إلى 400x باستخدام الهدف 40x وأعد وضع طرف القطب حسب الحاجة. اضبط النافذة الضوئية باستخدام برنامج القياس الضوئي للتركيز على ~ 50 إلى 80 خلية بطانية.
- ضع القطب برفق في إحدى خلايا الأنبوب البطاني باستخدام المعالج الدقيق وانتظر ≥2 دقيقة حتى يستقر Vm المريح. وبالمثل ، أدخل قطبا كهربائيا ثانيا في خلية أخرى (المسافة ≥100 ميكرومتر) من الخلية الأولى المخوزقة بالقطب الأول.
- بمجرد أن يستريح Vm مستقر عند قيمه المتوقعة (-30 إلى -40 مللي فولت) ، قم بتشغيل PMT على واجهة التألق في حالة عدم وجود ضوء وابدأ في اكتساب [Ca 2 + ] i عن طريق إثارة Fura-2 بالتناوب (10 هرتز) عند 340 و 380 نانومتر أثناء جمع انبعاث التألق عند 510 نانومتر.
ملاحظة: لاختبار الاقتران الكهربائي بين الخلايا ، يمكن تسليم التيار (± 0.5-3 نانو أمبير ، ~ 20 ثانية مدة النبضة) عن طريق مقياس كهربائي واحد ك "الموقع 1" ، ويمكن تسجيل تغييرات V m باستخدام مقياس كهربي آخر ك "الموقع 2" (المسافة ≥100 ميكرومتر).
- بمجرد إنشاء القياسات المتزامنة ل V m و [Ca 2 + ] i ، اسمح ~ 5 دقائق للضهار الفائق للأنبوب البطاني مع PSS بمعدل تدفق رقائقي ثابت قبل استخدام الأدوية.
- ضع الدواء (على سبيل المثال ، أدينوسين ثلاثي الفوسفات [ATP]) المحضر في PSS على غرفة الصخ الفائق بمعدل تدفق ثابت. بعد ~ 3 دقائق (أو فترة زمنية مناسبة لحركية الدواء) ، اغسل ب PSS حتى تعود نسبة V m و F 340 / F 380 إلى شروطها الأساسية. ضع علامة على التسجيلات المعنية على أنها متزامنة مؤقتا عبر مجموعات برامج مقياس الضوء ومقياس الكترب أثناء كل انتقال للحلول.
- بمجرد الانتهاء من التجربة ، اسحب القطب الكهربائي من الخلية باستخدام المعالج الدقيق ولاحظ V m ~ 0 mV كما هو مشار إليه بواسطة قطب الحمام. أوقف التسجيلات الخاصة ب Vm و [Ca2+]i واحفظ السجلات في الملف لتحليل البيانات.
