مقالة منهجية

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

DOI:

10.3791/3125

⸱

نوفمبر 13, 2011

 ,  ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يتطلب

تعبير الحمض النووي الريبي لمناطق دماغ الفأر المنفصلة استراتيجية دقيقة وقابلة للتكرار لجمع الأنسجة. يتم وصف البروتوكول الذي يستخدم كلا من قسم الدماغ الإكليلي والتشريح المجهري بمساعدة الأنسجة هنا يؤكد عائد وجودة إجمالي الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من العينات الناتجة فائدة الطريقة الموضحة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمنصات تكنولوجية ، فإن الأساليب مثل تسلسل الجيل التالي ، والمصفوفة الدقيقة ، و qRT-PCR لها وعد كبير لتوسيع فهمنا لاتساع نطاق التنظيم الجزيئي. توفر الأساليب الأحدث مثل تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الدقة (RNA-Seq) 1 معلومات جديدة وموسعة حول التعبير الخاص بالأنسجة أو الحالة مثل مستويات النسخ النسبية والتضفير البديل والحمض النووي الريبي الصغير2-4. توفر احتمالات استخدام طريقة RNA-Seq في التنميط المقارن للنسخ الكاملة5 داخل الأنسجة المنفصلة أو بين مجموعات متميزة من الأفراد طرقا جديدة لتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في كل من الحالات الفسيولوجية الطبيعية وغير الطبيعية. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء توصيف النسخ الكامل على أنسجة المخ البشري ، وتحديد اختلافات التعبير الجيني المرتبطة بتطور المرض6. ومع ذلك ، فإن استخدام تسلسل الجيل التالي لم يتم إدماجه على نطاق أوسع في دراسات الثدييات. < p class = "jove_content" > أبلغت دراسات التعبير الجيني في نماذج الفئران عن ملفات تعريف مميزة داخل نوى الدماغ المختلفة باستخدام الفحص المجهري لالتقاط الليزر (LCM) لاستئصال العينة7،8. في حين أن المضاعف المشترك الأصغر يوفر جمع العينات بدقة منطقة الدماغ أحادية الخلية والمنفصلة ، فإن إجمالي إنتاجية الحمض النووي الريبي المنخفض نسبيا من نهج المضاعف المشترك الأصغر يمكن أن يكون باهظا على RNA-Seq وأساليب التنميط الأخرى في أنسجة دماغ الفئران وقد تتطلب خطوات تضخيم العينة دون المستوى الأمثل. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتشريح الدقيق واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مناطق دماغ الفأر المنفصلة. تستخدم أدوات حفر الأنسجة ذات القطر المحدد لعزل 13 نسيجا من الأقسام الإكليلية التسلسلية 750 ميكرومتر لدماغ الفأر الفردي. يتم تجميد عينات الأنسجة الدقيقة وأرشفتها على الفور. يتم الحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي من العينات باستخدام تقنية عزل الحمض النووي الريبي الكلي المدعومة بالخرزة المغناطيسية. تتمتع عينات الحمض النووي الريبي الناتجة بإنتاجية وجودة كافيين لاستخدامها في توصيف التعبير النهائي. توفر استراتيجية التشريح الدقيق هذه خيارا قابلا للتطبيق لاستراتيجيات جمع العينات الحالية للحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي من مناطق الدماغ المنفصلة ، مما يفتح إمكانيات لاكتشافات التعبير الجيني الجديدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وإعداد أخذ العينات

  1. استكمل محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) مع بيكربونات الصوديوم (0.44 جم لكل 100 مل من EBSS) والجلوكوز (0.884 جم لكل 100 مل من EBSS)9. عالج EBSS باستخدام DEPC (0.1 مل لكل 100 مل من EBSS) لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية في زجاجة أو قارورة قابلة للتعقيم بسطح لولبي.
  2. ضع ماصات باستور زجاجية مقاس 5 3/4 بوصة في دورق زجاجي سعة 1000 مل ، وضع فرش الفنان ، مع توجيه الشعيرات لأعلى ، في أسطوانة زجاجية متدرجة سعة 100 مل. أضف محلول DEPC كاف (0.1 مل لكل 100 مل ddH2O) لتغطية الماصات والفرش ، على التوالي. قم بتغطية الدورق والأسطوانة المتدرجة بورق الألمنيوم ، واحتضانه لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد حضانة لمدة 12 ساعة مع DEPC ، قم بتسخين جميع المواد المعالجة DEPC إلى درجة حرارة >100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. قم بإزالة EBSS وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل التخزين عند 4 درجات مئوية. صب ddH2O بعيدا عن الدورق والأسطوانة المتدرجة ؛ استمر في الحضانة عند >100 درجة مئوية حتى تجف المواد. ترفع وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزن لاستخدامها لاحقا.
  4. في يوم التجربة ، عالج جميع أسطح العمل باستخدام RNaseZap.
  5. ضع EBSS وحافظ عليه في حمام مائي على درجة حرارة 40 درجة مئوية. لتخزين EBSS وتزويده بالأكسجين، قم بالتسلل بنسبة 95٪/5٪ O2/CO2 عن طريق وضع أنابيب الغاز في ماصة باستور خالية من RNase وإدخال الماصة في EBSS. قم بتغطية فتحة حاوية EBSS.
  6. قم بإعداد قطاعة الأنسجة Stoelting لاستخدامها في التقسيم التسلسلي لأنسجة المخ. عالج الأسطح العلوية والسفلية لقطاعة الأنسجة باستخدام RNaseZap. قم بتوصيل قطعة مستطيلة من ورق الترشيح Whatman # 4 بسطح زجاج شبكي لمفرمة المناديل. قم بتوصيل شفرة حلاقة مزدوجة الحواف بذراع المروحية. اضبط الميكرومتر على الصفر، واضبط الحد الأدنى لارتفاع ذراع المروحية للسماح لشفرة الحلاقة بقص ورق الترشيح، ولكن ليس اللوحة الزجاجية.
  7. اجمع جميع المواد الإضافية اللازمة للتشريح المجهري ، بما في ذلك أطباق زراعة الخلايا الخالية من RNase مقاس 60 × 15 مم ، وأدوات حفر الأنسجة Harris Uni-Core ، وأطراف الماصات الدقيقة الخالية من RNase سعة 200 ميكرولتر للتثبيت على أنابيب الغاز لأكسجين EBSS لأقسام الدماغ الإكليلية أثناء تثقيب العينات المجهرية ، والمقص المنحني ، والثلج الجاف ، والأنابيب لجمع الأنسجة. ضع الأنابيب على الثلج الجاف.
< p class = "jove_title" >2. إزالة الدماغ والتقطيع الإكليلي

  1. ضع الماوس في DecapiCone وقطع رأسه باستخدام مقصلة القوارض. قم بإزالة الرأس من DecapiCone وضعه على سطح مستو. باستخدام مشرط ، قم بقص الجلد أسفل خط الوسط للجمجمة بدءا من حوالي 3 مم الذيلية إلى فتحة الأنف. قشر اللوحات الجلدية بشكل جانبي لكشف الجمجمة ومآخذ العين.
  2. باستخدام مقص منحني ، قم بقطع كلا الأعصاب البصرية ، وقطع اتصالهما بالعين. افتح تجويف الجمجمة عن طريق كسر العظام القذالية وبين الجدارية بعناية وإزالة العظام الجدارية الظهرية والأمامية. باستخدام عظام العظام ، قم بكسر عظام الأنف والدمعية لفضح البصيلات الشمية. استخدم مقصا منحنيا لقطع البصيلات الشمية بعيدا عن الدماغ المنقاري. قم بإزالة الدماغ كله مع الدماغ الخلفي سليما. ضع الدماغ في الجزء العلوي من طبق ثقافة خلايا Cellstar خال من RNase مقاس 60 × 15 مم. نقل إلى سطح عمل أخذ عينات الأنسجة.
  3. استخدم ماصة خالية من RNase لترطيب ورق الترشيح بشكل متحفظ في مفرمة المناديل المرفقة باستخدام EBSS. بلل أنسجة المخ باستخدام EBSS.
  4. انقل الدماغ إلى مفرمة الأنسجة وقم بإعداد الاتجاه المناسب. ملاحظة: يجب وضع الدماغ مع وضع السطح البطني على ورق الترشيح. يجب أن يكون خط الوسط (الشق بين نصف الكرة الأرضية) عموديا على شفرة المروحية ، ويجب أن تكون الحافة المنقارية للدماغ متاخمة للشفرة.
  5. استخدم فرشاة فنان معالجة ب DEPC لإبقاء الدماغ ثابتا عن طريق الضغط برفق على السطح الظهري للدماغ. أثناء تثبيت الدماغ ثابتا ، ارفع ذراع حامل الشفرة لأعلى حوالي 4-5 سم فوق سطح الأنسجة الظهرية واحتفظ به في هذا الوضع. قم بإزالة الفرشاة من سطح الدماغ ، واطلب 750 ميكرومتر باستخدام الميكرومتر. اسمح للرافعة بالسقوط ، وتقطيع الأنسجة وإنشاء قسم إكليلي 750 ميكرومتر.
  6. بينما تظل شفرة المفرمة ثابتة ، استخدم حركة دحرجة بفرشاة الفنان لتمرير قسم المناديل برفق بعيدا عن سطح الشفرة. ضع قسم الأنسجة على الفور في EBSS المؤكسج في طبق بتري. يمكن للمحقق الثاني أن يبدأ في الخطوة 3.1.
  7. كرر الخطوتين 2.5 و 2.6 حتى يتم الحصول على أقسام الدماغ التسلسلية عبر مستوى الروسترو الذيلية بأكمله.

3. التشريح المجهري لمنطقة الدماغ

  1. اضبط الإضاءة للتأكد من عدم إعاقة إضاءة العينة أثناء التشريح المجهري للأنسجة. اضبط موضع وتدفق مزيج 95٪ / 5٪ من O2 / CO2 للحفاظ على بيئة مخزنة ومؤكسجة للأنسجة أثناء التشريح المجهري.
  2. حدد قسم الدماغ الإكليلي الذي يتضمن منطقة الاهتمام. قم بتوجيه قسم الدماغ بشكل مسطح في قاع طبق بتري باستخدام فرشاة فنان. حدد أداة التنظيف ذات القطر المناسب بناء على الجدول 1 أو مراجع أخرى. أثناء تثبيت قسم الأنسجة الإكليلية في مكانه باستخدام فرشاة الفنان ، قم بإحضار طرف القطع لآلة الأنسجة لأسفل فوق سطح قسم الأنسجة.
  3. أثناء الضغط ، اضغط على طرف الأنسجة من خلال قسم الأنسجة ولأسفل بقوة على قاع طبق بتري. استخدم حركة دائرية متدحرجة للتأكد من أن منطقة الاهتمام قد تم فصلها عن الأنسجة المحيطة. ارفع حفرة الأنسجة بعناية بعيدا عن قسم الأنسجة وحرر الثقب الدقيق ، مما يسمح له بالطفو في EBSS.
  4. باستخدام فرشاة الفنان ، قم على الفور بإيداع الأنسجة الدقيقة في أنبوب تخزين مستقر -80 درجة مئوية محفوظ على الثلج الجاف. يجب أن تلتصق الأنسجة بسهولة بجانب الأنبوب. أعد الأنبوب المحتوي على العينة الدقيقة إلى الثلج الجاف.
  5. كرر الخطوات 3.2 - 3.4 لكل منطقة من مناطق الدماغ ذات الأهمية.
فئة

4. أرشفة الأنسجة

  1. بمجرد اكتمال التشريح المجهري ، استخدم نظام الماسح الضوئي VisionMate لتسجيل الرموز الشريطية المعنية لكل أنبوب TrakMates يحتوي على عينة. بمجرد ملء الرف الأنبوبي TrakMates المكون من 96 فتحة ، قم بمسح الرف بسرعة وضع عينات المناديل على الفور في فريزر -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
فئة

5. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي

  1. قم بإعداد مساحة عمل خالية من RNase باستخدام RNaseZap. قم بإعداد كمية كافية من مزيج الخرز المغناطيسي ومحلول التحلل / الربط كما هو موضح في بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الكلي MagMAX-9610.
  2. قم بإزالة عينات المناديل من الفريزر -80 درجة مئوية وضع الأنابيب مباشرة على الثلج الجاف.
  3. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل / الربط إلى أنبوب TrakMates يحتوي على عينة. قم بتوصيل مدقة بحجم أنبوب 0.5 مل خالية من النوكلياز بخلاط الحبيبات وقم بتجانس الأنسجة. باستخدام طرف ماصة خال من النوكلياز منخفض الاحتجاز ، انقل العينة المتجانسة إلى بئر على صفيحة زراعة أنسجة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا. أضف على الفور 60 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى العينة باستخدام طرف ماصة خال من النوكلياز منخفض الاحتجاز، واخلطه عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل 3-4 مرات.
  4. أضف 20 ميكرولتر من مزيج الخرز إلى العينة باستخدام طرف ماصة منخفض الاحتجاز وخالي من النوكلياز. تخلط عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل 3-4 مرات.
  5. كرر الخطوات 5.3-5.4 لجميع عينات الأنسجة.
  6. اتبع خطوات بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الكلي MagMAX-96 بدءا من III.A.2 لإكمال استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. ملاحظه: تتوفر مجموعات عزل الحمض النووي الريبي الكلي الأخرى التي تدعم الخرزة المغناطيسية تجاريا. ومع ذلك ، لم يتم فحصها في هذه الدراسة. يرجى الرجوع إلى أدلة مجموعة الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل العزل الكلي للحمض النووي الريبي باستخدام المنتجات المعنية.
  7. قم بقياس نقاء وتركيز الحمض النووي الريبي الكلي الناتج باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 3300 أو غيرها من تقنيات مقياس الطيف الضوئي / مقياس الفلور صغير الحجم.
< p class = "jove_title" >6. النتائج التمثيلية:

منطقة الدماغ / النواة قطر الأنسجة (مم) إجمالي الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر) نسبة 260/280 القشرة الأمامية 2.0 27.03 دولار 1.99 نواة Accumbens 1.0 6.26 [إك] 2.77 [إك] المخطط 1.5 27.94 دولار 2.19 دولار القشرة الحزامية 1.5 29.05 دولار 2.07 دولار تحت المهاد - النواة المجاورة للبطينات / النواة فوق البطينية (PVN / SCN) 2.0 40.34 2.03 دولار المهاد 2.0 34.40 دولار 2.00 تحت المهاد - النواة الظهرية / النواة البطنية الإنية (DMH / VMH) 2.0 44.83 2.05 دولار اللوزة 1.0 10.06 1.89 دولار أمريكي الحصين - Ca 2/3 1.5 7.31 دولار أمريكي 2.32 دولار أمريكي الحصين - Ca1 / التلفيف المسنن 1.5 5.20 2.24 [إ] رمادي محيطي القناتي 1.0 48.21 دولار 2.02 نواة راف الظهرية 1.0 6.56 دولار أمريكي 2.18 [إ] التشكيل الشبكي 2.0 35.35 دولار 2.27 [إ] < p class = "jove_content" >الجدول 1. تعداد مناطق دماغ الفأر المجهرية مع أقطار الأنسجة المثلى ذات الصلة ، وإجمالي إنتاجية الحمض النووي الريبي والنقاء. تختلف مناطق الدماغ ال 13 التي تم تشريحها المجهري ، المدرجة بترتيب روسترو الذيلية ، في الحجم والاتجاه. تشتمل PVN / SCN micropunch على النواة المجاورة للبطين الأمامية ، وأجزاء من النواة المحيطة بالبطين ، والمنطقة تحت البطينية والخلايا العصبية الصغيرة الأخرى. تشتمل المهاد micropunch على نوى المهاد الأمامية الموجودة في نفس المستوى الإكليلي مثل منطقة PVN / SCN micropunch. تشتمل DMH / VMH micropunch على نوى الخلايا المكسونية الملحقة والخلايا العصبية الصغيرة الأخرى الموجودة بين النواة الظهرية والنواة البطنية. تشمل عينة اللوزة كلا من المناطق الفرعية الوسطى والقاعدية الجانبية. عائد الحمض النووي الريبي ونسب 260/280 هي قيم مفردة تم الحصول عليها من عينات التشريح الدقيق المعنية لإثبات القراءات التي تم الحصول عليها من كل منطقة من مناطق الدماغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تستدعي اهتماما ودراسة متأنية. يجب تحديد اختيار قطر حفرة الأنسجة المناسب لإزالة كل منطقة ذات اهتمام. في حين أن أقطار حفر الأنسجة المعروضة في الجدول 1 مناسبة لجمع مناطق الدماغ المدرجة ، يجب على كل محقق تحديد أداة حفر الأنسجة ذات الحجم المناسب من أجل الجمع الأمثل للأنسجة (الأنسجة) ذات الأهمية. ثانيا ، تم تحديد سمك المقطع الإكليلي المبلغ عنه في هذه الطريقة (750 ميكرومتر) تجريبيا ليكون الأمثل لتحديد مناطق الدماغ ذات الأهمية (الجدول 1) في الفئران البالغة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">تم تمويل هذا العمل من قبل وكالة مشاريع الأبحاث الدفاعية المتقدمة (DARPA) ومكتب أبحاث الجيش (ARO) ، رقم الجائزة W911NF-10-1-006.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

حمام EPTIPS خالية من

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مائي Isotemp 102فيشر Scientific15-460-3Q
RNase ZapAmbionAM9782
مختبر دوار (شاكر مداري)Thermo Fisher Scientific، Inc.2314 &# 8211 ؛ - 1CEQ
خلاط بيليهVWR الدولي47747-370
RNase خال من 0.5 مل مدقةVWR الدوليةKT749521-0590
بيروكربونات ثنائي إيثيل خالية من Nuclease (DEPC)Sigma-AldrichD5758-50ML
شفرات حلاقة مزدوجة الحوافStoelting Co.51427
شارع &# 8211 ؛ تقطيع الأنسجة مع ميكرومتر يدويStoelting Co.51425
2/0 فنان دائري' s فرشاةبرينستون آرتفرشاة 4350R
هاريس أحادي النواة للأنسجة (0.75 مم)تيد بيلا، إنك.15072
هاريس أحادي النواة للأنسجة (1.0 مم)تيد بيلا ، إنك.15099
هاريس أحادي النواة للأنسجة (1.5 مم)تيد بيلا، إنك.15075
هاريس أحادي النواة للأنسجة (2.0 مم)شركة تيد بيلا15076
مقصلةبرينتري العلمية ، إنك.RG-100
DecapiConesBraintree Scientific، Inc.MDC-200
HyClone إيرل محلول الملح المتوازن (EBSS) ThermoFisher Scientific، Inc.SH30029.02
ماصات سعة 25 ملCorning4489خالية من Nuclease
LoRetention Dualfilter نصائح ماصة ، 20 & [مدش] ؛ 300 مو ؛ LEppendorf0030 077.636
أنابيب علوية لولبية TrakMates مع أغطيةThermo Fisher Scientific، Inc.3741
قارئ الباركود اللاسلكي 2D VisionMateThermo Fisher Scientific، Inc.3122MTX
VisionMate SR رف واحد قارئ الباركود 2DThermo Fisher Scientific، Inc.3115
1-200 & L نصائح ماصة مناسبة عالميةCorning4864
أطباق زراعة خلايا CellstarNuclease Greiner Bio-One628160
Greiner Bio-One 96-well بوليسترين Cellstar لوحة زراعة الأنسجة الخالية من Nuclease ، U-bottomUSA Scientific، Inc.5665-0180Nuclease-free
# 4 ورق ترشيحWhatman ، GE Healthcare1004 150
حشو ماصة أمان من نوع لمبة السيليكونFisher Scientific13-681-102A
NanoDrop 3300 مقياس الطيفالضوئي الحراري فيشر العلمي ، Inc.إن دي -3300

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
  2. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
  3. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
  4. Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
  5. Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
  6. Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
  7. Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
  8. Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
  9. Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
  10. Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA EBSS

مقالات ذات صلة