يتطلب تحليل ملف تعبير RNA في مناطق محددة من دماغ الفأر استراتيجية دقيقة وقابلة للتكرار لجمع الأنسجة. يتم هنا وصف بروتوكول يستخدم كلاً من تقطيع الدماغ في المقطع الإكليلي والتشريح الدقيق بمساعدة ملقط أخذ العينات النسيجية. وتؤكد كمية وجودة RNA الكلي المستخلص من العينات الناتجة فائدة الطريقة الموضحة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتمتع المنصات التكنولوجية والنهج المتبعة، مثل تسلسل الجيل القادم (next-generation sequencing) والمصفوفات الدقيقة (microarray) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)، بوعود كبيرة لتوسيع فهمنا لنطاق التنظيم الجزيئي. وتوفر النهج الأحدث، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الدقة (RNA-Seq)1، معلومات جديدة وشاملة حول التعبير الجيني الخاص بالأنسجة أو الحالة، مثل مستويات النسخ النسبية، والربط البديل (alternative splicing)، والحمض النووي الريبي الميكروي (micro RNAs)2-4. كما أن آفاق استخدام طريقة RNA-Seq في التوصيف المقارن للنقح الشامل (whole transcriptome profiling)5 ضمن أنسجة منفصلة أو بين مجموعات من الأفراد المتميزين ظاهرياً تفتح مسارات جديدة لتوضيح الآليات الجزيئية المتضمنة في الحالات الفسيولوجية الطبيعية وغير الطبيعية على حد سواء. ومؤخراً، تم إجراء توصيف للنقح الشامل على أنسجة الدماغ البشري، مما أدى إلى تحديد الاختلافات في التعبير الجيني المرتبطة بتطور المرض6. ومع ذلك، لم يتم دمج استخدام تسلسل الجيل القادم بشكل أوسع بعد في الدراسات التي تُجرى على الثدييات.
أفادت دراسات التعبير الجيني في نماذج الفئران عن وجود ملفات تعريفية متميزة داخل مختلف نوى الدماغ باستخدام مجهر الالتقاط بالليزر (LCM) لاستئصال العينات7,8. وبينما يتيح نظام LCM جمع العينات بدقة تصل إلى مستوى الخلية الواحدة ومناطق الدماغ المحددة، فإن حصيلة الحمض النووي الريبي (RNA) الكلية المنخفضة نسبياً من نهج LCM قد تعيق إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) وغيرها من أساليب التوصيف في أنسجة دماغ الفئران، وقد تتطلب خطوات تضخيم عينات غير مثالية. وهنا، يتم تقديم بروتوكول للتشريح الدقيق واستخلاص الـ RNA الكلي من مناطق محددة في دماغ الفأر. تُستخدم أدوات ثقب الأنسجة ذات القطر المحدد لعزل 13 نسيجاً من مقاطع إكليلية متسلسلة بسمك 750-μm من دماغ فأر واحد. يتم تجميد عينات الثقب الدقيق للأنسجة وأرشفتها على الفور. ويتم الحصول على الـ RNA الكلي من العينات باستخدام تقنية عزل الـ RNA الكلي المعتمدة على الخرز المغناطيسي. وتتمتع عينات الـ RNA الناتجة بحصيلة وجودة كافيتين للاستخدام في توصيف التعبير الجيني اللاحق. توفر استراتيجية التشريح الدقيق هذه خياراً قابلاً للتطبيق مقارنة باستراتيجيات جمع العينات الحالية للحصول على الـ RNA الكلي من مناطق الدماغ المحددة، مما يفتح آفاقاً لاكتشافات جديدة في التعبير الجيني.
البروتوكول
1. إعداد وتجهيز عملية أخذ العينات
- قم بتدعيم محلول إيرل الملح المتوازن (EBSS) ببيكربونات الصوديوم (0.44 g لكل 100 mL من EBSS) والجلوكوز (0.884 g لكل 100 mL من EBSS)9. عالج محلول EBSS باستخدام DEPC (بمعدل 0.1 mL لكل 100 mL من EBSS) لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 °C في زجاجة أو دورق قابل للتعقيم بجهاز الأوتوكلاف ومزود بغطاء لولبي.
- ضع ماصات باستور زجاجية بحجم 5 ¾" في دورق زجاجي سعة 1000 mL، وضع فرش الرسم، بحيث تكون الشعيرات متجهة للأعلى، في مخبار زجاجي مدرج سعة 100 mL. أضف كمية كافية من محلول DEPC (بمعدل 0.1 mL لكل 100 mL من ddH2O) لتغطية الماصات والفرش، على التوالي. غطِ الدورق والمخبار المدرج بورق ألومنيوم، واتركهما في الحاضنة لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 °C.
- بعد الحضن لمدة 12 ساعة مع DEPC، سخن جميع المواد المعالجة بـ DEPC إلى درجة حرارة >100 °C لمدة 15 دقيقة على الأقل. أخرج محلول EBSS واتركه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل تخزينه عند 4 °C. قم بتفريغ ddH2O من الدورق والمخبار المدرج؛ واستمر في الحضن عند درجة حرارة >100 °C حتى تجف المواد. أخرجها، واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم خزنها لاستخدامها لاحقاً.
- في يوم التجربة، عالج جميع أسطح العمل باستخدام RNaseZap.
- ضع محلول EBSS وحافظ عليه في حمام مائي مضبوط عند 40 °C. ولموازنة وتزويد محلول EBSS بالأكسجين، قم بتمرير خليط 95%/5% O2/CO2 عن طريق وضع أنبوب غاز داخل ماصة باستور خالية من الـ RNase، ثم إدخال الماصة في محلول EBSS. غطِ فتحة وعاء EBSS.
- قم بتجهيز قطاعة أنسجة Stoelting لاستخدامها في التقطيع التسلسلي لأنسجة الدماغ. عالج الأسطح العلوية والسفلية لقطاعة الأنسجة باستخدام RNaseZap. ثبت قطعة مستطيلة من ورق ترشيح Whatman #4 على السطح الزجاجي (plexi-glass) لقطاعة الأنسجة. ثبت شفرة حلاقة مزدوجة الحواف بذراع القطاعة. اضبط الميكرومتر على الصفر، واضبط الارتفاع الأدنى لذراع القطاعة بحيث تسمح لشفرة الحلاقة بقطع ورق الترشيح، دون قطع اللوح الزجاجي.
- اجمع جميع المواد الإضافية اللازمة للتشريح المجهري، بما في ذلك أطباق زراعة الخلايا مقاس 60x15 mm الخالية من الـ RNase، وأدوات ثقب الأنسجة Harris Uni-Core، ورؤوس ماصات مجهرية سعة 200 μL خالية من الـ RNase لتثبيتها بأنابيب الغاز لأكسجة المقاطع الإكليلية للدماغ أثناء ثقب العينات المجهرية، ومقصات منحنية، وجليد جاف، وأنابيب لجمع الأنسجة. ضع الأنابيب على الجليد الجاف.
2. استئصال الدماغ والتقطيع الإكليلي
- ضع الفأر في DecapiCone وقم بفصل رأسه باستخدام مقصلة القوارض. أخرج الرأس من DecapiCone وضعه على سطح مستوٍ. باستخدام المشرط، اقطع الجلد على طول الخط المتوسط للجمجمة بدءاً من نقطة تبعد حوالي 3 mm خلف المنخر. قم بتقشير سدائل الجلد جانبياً لكشف القحف ومآقي العين.
- باستخدام مقصات منحنية، اقطع العصبين البصريين، مما يؤدي إلى قطع اتصالهما بالعين. افتح التجويف القحفي عن طريق كسر العظام القفوية وبين الجدارية بعناية وإزالة العظام الجدارية والجبهية الظهرية. باستخدام ملقط قضم العظام، اكسر العظام الأنفية والدمعية لكشف البصيلات الشمية. استخدم مقصات منحنية لقطع البصيلات الشمية بعيداً عن الجزء المنقاري من الدماغ. قم بإزالة الدماغ كاملاً مع الحفاظ على الدماغ الخلفي سليماً. ضع الدماغ في الجزء العلوي من طبق زراعة خلايا Cellstar مقاس 60 x 15 mm وخالٍ من RNase. انقله إلى سطح عمل أخذ عينات الأنسجة.
- استخدم ماصة خالية من RNase لترطيب ورق الترشيح المتصل بقطاعة الأنسجة باستخدام EBSS بحذر. بلل نسيج الدماغ بـ EBSS.
- انقل الدماغ إلى قطاعة الأنسجة وضع التوجيه المناسب. ملاحظة: يجب وضع الدماغ بحيث يستقر السطح البطني على ورق الترشيح. يجب أن يكون الخط المتوسط (الشق بين نصفي الكرة المخية) عمودياً على شفرة القطاعة، ويجب أن تكون الحافة المنقارية للدماغ ملاصقة للشفرة.
- استخدم فرشاة فنان معالجة بـ DEPC لتثبيت الدماغ في مكانه عن طريق تطبيق ضغط خفيف على السطح الظهري للدماغ. وأثناء تثبيت الدماغ، ارفع ذراع حامل الشفرة للأعلى بحوالي 4-5 cm فوق سطح النسيج الظهري وثبته في هذا الوضع. أزل الفرشاة من سطح الدماغ، واضبط القياس على 750 μm باستخدام الميكرومتر. اترك الذراع تسقط، لتقطع النسيج وتنشئ مقطعاً إكليلياً بسمك 750 μm.
- بينما تظل شفرة القطاعة ثابتة، استخدم حركة دائرية بفرشاة الفنان لمسح مقطع النسيج بلطف بعيداً عن سطح الشفرة. ضع مقطع النسيج فوراً في EBSS المؤكسج في طبق بتري. يمكن لباحث ثانٍ البدء في الخطوة 3.1.
- كرر الخطوتين 2.5 و 2.6 حتى يتم الحصول على مقاطع دماغية متسلسلة عبر المستوى المنقاري-الذيلي بالكامل.
3. التشريح المجهري لمنطقة الدماغ
- اضبط الإضاءة لضمان عدم حجب إنارة العينة أثناء عملية التشريح المجهري للأنسجة. اضبط موضع وتدفق خليط 95%/5% من O2/CO2 للحفاظ على بيئة مؤتمنة ومؤكسجة للأنسجة أثناء التشريح المجهري.
- حدد المقطع الإكليلي للدماغ الذي يتضمن المنطقة المستهدفة. وجه المقطع الدماغي ليكون مسطحاً في قاع طبق بتري باستخدام فرشاة رسم. اختر مثقاب الأنسجة ذو القطر المناسب بناءً على الجدول 1 أو مراجع أخرى. وبينما تقوم بتثبيت المقطع النسيجي الإكليلي في مكانه باستخدام فرشاة الرسم، أنزل طرف القطع الخاص بمثقاب الأنسجة فوق سطح المقطع النسيجي.
- أثناء تسليط الضغط، اضغط بطرف مثقاب الأنسجة عبر المقطع النسيجي وصولاً إلى قاع طبق بتري بقوة. استخدم حركة دائرية لضمان فصل المنطقة المستهدفة عن الأنسجة المحيطة. ارفع مثقاب الأنسجة بعناية بعيداً عن المقطع النسيجي وحرر العينة المقطوعة مجهرياً، واتركها تطفو في محلول EBSS.
- باستخدام فرشاة رسم، انقل العينة المقطوعة مجهرياً على الفور إلى أنبوب تخزين مستقر في درجة حرارة -80 °C ومحفوظ على الثلج الجاف. يجب أن تلتصق الأنسجة بسهولة بجدار الأنبوب. أعد الأنبوب الذي يحتوي على العينة المجهرية إلى الثلج الجاف.
- كرر الخطوات 3.2 - 3.4 لكل منطقة مستهدفة في الدماغ.
4. حفظ الأنسجة
- بمجرد اكتمال عملية التشريح الدقيق، استخدم نظام الماسح الضوئي VisionMate لتسجيل الرموز الشريطية (bar codes) المقابلة لكل أنبوبة TrakMates تحتوي على عينة. وبمجرد ملء رف أنابيب TrakMates المكون من 96 فتحة، قم بمسح الرف ضوئياً بسرعة وضع عينات الأنسجة فوراً في مجمد بدرجة حرارة -80 °C لحين استخلاص RNA.
5. استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA)
- قم بتجهيز مساحة عمل خالية من الـ RNase باستخدام RNaseZap. جهز كمية كافية من خليط الحبيبات المغناطيسية (Bead Mix) ومحلول التحلل/الربط (Lysis/Binding Solution) كما هو موضح في بروتوكول MagMAX-96 لعزل الـ RNA الكلي10.
- أخرج عينات الأنسجة من المجمد عند درجة حرارة -80 °C وضع الأنابيب مباشرة على الثلج الجاف.
- أضف 100 μL من محلول التحلل/الربط إلى أنبوب TrakMates الذي يحتوي على العينة. ثبّت مدقاً بحجم أنبوب 0.5 ml خالياً من النوكلياز في جهاز خلط الراسب وقم بتجانس النسيج. باستخدام رأس ماصة منخفض الالتصاق وخالٍ من النوكلياز، انقل العينة المتجانسة إلى بئر في طبق زراعة أنسجة ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً. أضف فوراً 60 μL من الإيزوبروبانول بتركيز 100% إلى العينة باستخدام رأس ماصة منخفض الالتصاق وخالٍ من النوكلياز، واخلط عن طريق السحب والطرد بالماصة من 3-4 مرات.
- أضف 20 μL من خليط الحبيبات (Bead Mix) إلى العينة باستخدام رأس ماصة منخفض الالتصاق وخالٍ من النوكلياز. اخلط عن طريق السحب والطرد بالماصة من 3-4 مرات.
- كرر الخطوتين 5.3-5.4 لجميع عينات الأنسجة.
- اتبع خطوات بروتوكول MagMAX-96 لعزل الـ RNA الكلي بدءاً من الخطوة III.A.2 لإتمام عملية استخلاص الـ RNA الكلي. ملاحظة: تتوفر تجارياً أطقم أخرى لعزل الـ RNA الكلي تعتمد على الحبيبات المغناطيسية؛ ومع ذلك، لم يتم فحصها في هذه الدراسة. يرجى الرجوع إلى أدلة استخدام الأطقم الخاصة بالشركة المصنعة للحصول على تفاصيل عزل الـ RNA الكلي باستخدام المنتجات المعنية.
- قس نقاء وتركيز الـ RNA الكلي الناتج باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 3300 أو غيره من تقنيات قياس الطيف الضوئي/الفلورية للأحجام الصغيرة.
6. النتائج التمثيلية:
| منطقة الدماغ/النواة | قطر مخرزة الأنسجة (mm) | إجمالي RNA (ng/μL) | نسبة 260/280 |
| القشرة الجبهية | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| النواة المتكئة | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| الجسم المخطط | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| القشرة الحزامية | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| الوطاء - النواة المجاورة للبطين / النواة فوق التصالبية (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| المهاد | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| الوطاء - النواة الظهرية الإنسية / النواة البطنية الإنسية (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| اللوزة | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| الحصين - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| الحصين - Ca1/التلفيف المسنن | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| المادة الرمادية المحيطة بالمسال | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| نواة الرفاء الظهرية | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| التكوين الشبكي | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
الجدول 1. تعداد مناطق دماغ الفأر التي تم تشريحها مجهرياً مع أقطار مخرزات الأنسجة المثالية المقابلة لها، وإنتاجية RNA الكلية النموذجية ونقائها. تختلف مناطق الدماغ الـ 13 التي تم تشريحها مجهرياً، والمدرجة بترتيب من المنخار إلى الذيل (rostro-caudal)، في الحجم والاتجاه. تتضمن عينة الثقب المجهري لـ PVN/SCN النواة المجاورة للبطينات الأمامية الإنسية، وأجزاء من النواة المجاورة للبطينات، والمنطقة تحت المجاورة للبطينات وعصبونات صغرية أخرى. وتتضمن عينة الثقب المجهري للمهاد أنوية المهاد الأمامية الواقعة في نفس المستوى الإكليلي لمنطقة الثقب المجهري لـ PVN/SCN. كما تتضمن عينة الثقب المجهري لـ DMH/VMH أنوية كبرية ملحقة وعصبونات صغرية أخرى تقع بين النواة الظهرية الإنسية والنواة البطنية الإنسية. وتشمل عينة اللوزة الدماغية كلاً من المناطق الفرعية المركزية والقاعدية الجانبية. تمثل قيم إنتاجية RNA ونسب 260/280 قيماً فردية تم الحصول عليها من عينات التشريح المجهري المقابلة لتوضيح القراءات التي تم الحصول عليها من كل منطقة في الدماغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات الحرجة في هذا البروتوكول التي تتطلب عناية واهتماماً دقيقين. يجب تحديد قطر مخرزة الأنسجة المناسب لإزالة كل منطقة اهتمام على حدة. وبينما تعد أقطار مخرزة الأنسجة الموضحة في الجدول 1 مناسبة لجمع مناطق الدماغ المدرجة، يجب على كل باحث تحديد الحجم المناسب لمخرزة الأنسجة لضمان الجمع الأمثل للأنسجة المعنية في دراسته. ثانياً، تم تحديد سمك المقطع الإكليلي المذكور في هذه الطريقة (750 μm) تجريبياً ليكون الأمثل لتحديد مناطق الدماغ المستهدفة (الجدول 1) في الفئران البالغة من خلفيات وراثية متنوعة. ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (DARPA) ومكتب أبحاث الجيش (ARO)، رقم المنحة W911NF-10-1-006.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حمام مائي Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| هزاز مختبري (هزاز مداري) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| خلاط الكريات | VWR international | 47747-370 | |
| مدقة حجم 0.5 مل خالية من إنزيم RNase | VWR international | KT749521-0590 | خالٍ من النوكلييز |
| ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50مل | |
| شفرات حلاقة ذات حدين | Stoelting Co. | 51427 | |
| ست–قطاعة أنسجة بالتجميد مع ميكرومتر يدوي | Stoelting Co. | 51425 | |
| فرشاة رسم مستديرة مقاس 2/0’فرشاة s | فرشاة برينستون الفنية | 4350R | |
| أداة أخذ خزعات أنسجية Harris Uni-Core (0.75 مم) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| أداة استئصال عينات الأنسجة Harris Uni-Core (1.0 مم) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| أداة استئصال عينات الأنسجة Harris Uni-Core (1.5 مم) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| أداة استخراج عينات الأنسجة Harris Uni-Core (2.0 مم) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| المقصلة | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| مخروطات إزالة الرأس (DecapiCones) | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’محلول ملحي متوازن معزز (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| ماصات سعة 25 ملللتر | Corning | 4489 | خالٍ من النيوكليز |
| رؤوس ماصات epT.I.P.S. ذات الاحتفاظ المنخفض وفلتر مزدوج، 20 — 300 μلـ | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| أنابيب TrakMates ذات الغطاء اللولبي مع الأغطية | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| قارئ الرموز الشريطية ثنائي الأبعاد اللاسلكي VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| قارئ الباركود ثنائي الأبعاد VisionMate SR للرف الواحد | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μرؤوس ماصات عالمية الملاءمة من L | Corning | 4864 | خالٍ من النيوكلييز |
| أطباق زراعة الخلايا Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | خالٍ من النيوكلياز |
| طبق زراعة أنسجة Cellstar من البوليسترين بـ 96 بئراً وقاع على شكل حرف U من شركة Greiner Bio-One | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | خالٍ من النوكلييز |
| #4 ورق ترشيح | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| أداة ملء الماصات الآمنة من النوع البصيلة السيليكونية | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
المراجع
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
