تصوير إشارات الكالسيوم التي يسببها النيكوتين على طول محاور الحصين البطنية في الثقافات المشتركة المشبكية

الملخص

المصدر: Zhong ، C. ، et al. ، تصوير حي لإشارات الكالسيوم التي يسببها النيكوتين وإطلاق الناقل العصبي على طول محاور الحصين البطنية. J. Vis. Exp. (2015)

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو كيف يؤدي التنشيط بوساطة النيكوتين لمستقبلات أستيل كولين النيكوتين في الحصين البطني للفأر إلى إشارات الكالسيوم المستمرة على طول المحاور.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

فئة

1. تصوير الكالسيوم

1. اشطف المزارع (5-7 أيام في المختبر) بسرعة باستخدام HBS العادي ، ثم قم بتحميل المزارع بمؤشر 5 ميكرومتر Fluo-4 Ca²⁺ (AM ester) و 0.02٪ Pluronic F-127 في HBS (2 مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
2. اغسل محلول Fluo-4 باستخدام HBS (3 مرات / 5 دقائق). أعد المزارع إلى الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. الحفاظ على الثقافات (5-7 أيام في المختبر) في غرفة التصوير وتركيب الغرفة على مجهر متحد البؤر للقرص الدوار. النفخ باستمرار (1 مل / دقيقة) مع كوكتيل HBS في RT.
4. اجمع صور Fluo-4 المضان للإسقاطات المحورية من شرائح vHipp الدقيقة بهدف Plan-Apochromat (60X ماء مع 1.4 NA ، إثارة 488 نانومتر ، انبعاث 530 نانومتر) وكاميرا CCD.
5. اجمع صور مضان Fluo-4 الأساسية (كل 10 ثوان لمدة دقيقتين) كعنصر تحكم ما قبل النيكوتين. ضع النيكوتين (1 ميكرومتر) عن طريق التروية السريعة (2 مل / دقيقة) لمدة دقيقة واحدة ، ثم اغسل النيكوتين بكوكتيل HBS. استمر في التقاط صور بفاصل زمني قبل وأثناء وبعد تطبيق النيكوتين كل 10 ثوان لمدة 30 دقيقة.
6. احفظ جميع إطارات الصور المضان الخام fluo-4 وقم بتصديرها كسلسلة من صور TIFF لمزيد من التحليل.
7. اجمع الكثافة المتكاملة لفلورة fluo-4 على طول محاور vHipp قبل وبعد استخدام النيكوتين.
8. تطبيع شدة التألق المتكاملة بالمعادلة التالية: ΔF / F₀ = (F-F₀) / F₀ ، حيث F₀ هي شدة التألق المتكاملة قبل النيكوتين المصححة في الخلفية ، و F هي شدة التألق المتكاملة على طول محاور vHipp في كل نقطة زمنية بعد تطبيق النيكوتين. تحليل ورسم شدة التألق المتكاملة الطبيعية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كوكتيل HBS للتصوير الحي ، الرقم الهيدروجيني = 7.3 كلوريد الصوديوم سيغما S9888 135 ملم كيه سي إل سيغما ص 9333 5 مللي متر كلوريد المغنيسيوم سيغما M8266 1 ملي متر كلوريد الكالسيوم سيغما سي 1016 2 مللي هيبس سيغما إتش 3375 10 ملم الجلوكوز سيغما G0350500 10 ملم السموم الرباعية توكرس 1078 2 ميكرومتر بيكوكولين توكرس 131 10 ميكرومتر د-AP-5 توكرس 105 50 ميكرومتر CNQX توكرس 1045 20 ميكرومتر LY341495 توكرس 1209 10 ميكرومتر