التحقيق في إمكانات إزالة الاستقطاب المطولة (PDA) في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية

الملخص

المصدر: Gutorov, R., et al. طرق الفيزيولوجيا الكهربية لقياس مستويات الصبغة الضوئية في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا تجريبيا للتحقيق في إمكانات إزالة الاستقطاب المطولة (PDA) في ذبابة الفاكهة ذات العيون البيضاء. تتعرض عين الذبابة لنبضات الضوء الأزرق المكثفة لتحويل الصبغة الضوئية رودوبسين إلى ميتارودوبسين ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات تفتح قنوات أيونية موجبة وتسبب إزالة الاستقطاب الغشائية. نظرا لأن الضوء الأزرق يمنع إعادة تحويل الميتارودوبسين إلى رودوبسين ، فإن التدفق المستمر للأيونات الموجبة يؤدي إلى إزالة الاستقطاب المستمر ، والمعروف باسم جهد إزالة الاستقطاب المطول (PDA).

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. قياس الجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) باستخدام مخطط كهربية الشبكية

1. ظروف تربية مناسبة لتحضير ذبابة الفاكهة السوداء
   1. رفع D. melanogaster الذباب في زجاجات تحتوي على ذرة صفراء قياسية تحتوي على طعام في حاضنة يتم الاحتفاظ بها عند درجة حرارة 24 درجة مئوية وفي دورة ظلام / ضوء لمدة 12 ساعة.
   2. احتفظ بزجاجات الذباب في الظلام قبل 24 ساعة على الأقل من التجربة.
2. الإعداد العام
   1. قم بإعداد ماصات التسجيل عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات المملوءة بالألياف مقاس 1 مم × 0.58 مم (OD × ID) (الشكل 1L، O). يجب أن تكون مقاومة الماصات 5-10 MΩ ؛ يمكن استخدام أي مجتذب مناسب.
   2. قم بتغطية سلكين فضيين ب AgCl₂ ، وإدخال سلك فضي 0.25 مم في محلول 3 M KCl متصل بمصدر طاقة 5 فولت مخصص.
   3. أدخل كل سلك فضي مطلي في حاملات الأقطاب الكهربائية (الشكل 1N).
   4. املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول Ringer المصفى (انظر الجدول 1) باستخدام حقنة ممدودة (الشكل 1M).
   5. أدخل القطب الكهربائي السلكي في الشعيرات الدموية الزجاجية. تأكد من أن المحلول الموجود داخل الشعيرات الدموية ملامسة للسلك الفضي.
   6. أدخل حاملي الأقطاب الكهربائية (الشكل 2P ، N) في اثنين من المعالجات الدقيقة للقطب الكهربائي (الشكل 2G).
3. إجراء تحضير الذبابة للتسجيلات الكهربائية
   ملاحظة: للحفاظ على الذبابة في ظروف متكيفة مع الظلام ، استخدم فقط إضاءة الضوء الأحمر الخافت خلال الخطوات التالية.
   1. قم بتخدير الذباب في الزجاجة بغاز ثاني أكسيد الكربون₂ باستخدام نظام نائم الذباب (الشكل 1 أ ، ب) واسكبه في الحاوية النائمة.
   2. اختر ذبابة واحدة وامسكها بعناية من جناحها باستخدام ملقط حاد. غطي باقي الذباب بطبق بتري.
   3. ضع الذبابة على حامل الذبابة في الاتجاه الصحيح - ملقاة على جانبها ، مع ظهرها نحو اليد (الشكل 1P).
   4. قم بتشغيل مصدر الطاقة لمكواة اللحام. اضبط التيار على ~ 2.25 أمبير. يجب أن يسخن هذا التيار خيوط البلاتين والإيريديوم 0.25 مم إلى ~ 55-56 درجة مئوية.
   5. ضع قطرة من الشمع بدرجة حرارة انصهار منخفضة (~ 55-56 درجة مئوية) على مكواة اللحام (الشكل 1F).
   6. باستخدام الملقط ، ارفع الذبابة من أجنحتها وثبت جناحيها على حامل الذبابة (الشكل 1I) باستخدام مكواة اللحام.
   7. باستخدام مكواة اللحام ، قم بتوصيل ظهر الذبابة بسطح الحامل بالشمع (الشكل 1P).
   8. اخفض طرف مكواة اللحام على نقطة الوصل للأرجل وقم بإذابة الشمع لتغطية جميع الأرجل معا (الشكل 1P).
   9. ضع قطرة صغيرة من الشمع بين الرأس والظهر في منطقة الرقبة (الشكل 1P).
      ملاحظة: توخي الحذر بشكل خاص لتجنب ارتفاع درجة حرارة رأس الذبابة. تأكد من أن الذبابة مثبتة بشكل صحيح وغير قادرة على التحرك أثناء التجربة ؛ قد تؤدي الحركات الثانوية إلى إنشاء قطع أثرية في التسجيلات. تأكد من أن فتحات القصبة الهوائية (مداخل التنفس) في الصدر والبطن غير مغطاة بالشمع.
   10. ضع حامل الذبابة (الشكل 2Q) في قفص فاراداي مظلم على كتلة مغناطيسية (الشكل 2I) وتأكد من أن الذبابة ~ 5 مم من نهاية دليل الضوء (الشكل 2L).
   11. ضع قطب التسجيل (الشكل 2P) فوق عين الذبابة والقطب الأرضي (الشكل 2N) فوق الجزء العلوي من ظهر الذبابة باستخدام المعالجات الدقيقة.
   12. أدخل القطب الأرضي في الجزء الخلفي من الذبابة باستخدام المعالجات الدقيقة.
   13. أدخل قطب التسجيل في المحيط الخارجي لعين الذبابة ، ويفضل استخدام أجهزة المعالجة الدقيقة.
       ملاحظه: بعد إدخال القطب الكهربائي في العين ، سيتم ملاحظة غمازة صغيرة ؛ اسحب القطب لأعلى دون إزالته من العين حتى تختفي الغمازة. يمكن أيضا غمر الأقطاب الكهربائية في قطرات صغيرة من هلام القطب الكهربائي المطبقة على الجذع والعين.
4. بروتوكول المساعد الرقمي الشخصي (لا يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إلا على الذباب ذو العيون البيضاء)
   1. أعط نبضة ضوئية 5 ثوان بأقصى كثافة باستخدام مرشح برتقالي (مرشح حافة 590 ، لتحويل الصبغة الضوئية القصوى إلى حالة R).
   2. استبدل المرشح البرتقالي بمرشح أزرق عريض النطاق (BP450 / 40 نانومتر) وأعط ثلاث نبضات ضوئية 5 ثوان بأقصى شدة.
      ملاحظة: من الممكن أيضا إعطاء نبضة ضوء أزرق طويلة مستمرة ومستمرة حتى يتم الوصول إلى استجابة جهد الحالة المستقرة.
   3. انتظر 60 ثانية في الظلام ، واستبدل المرشح الأزرق بالمرشح البرتقالي السابق ، وأعط نبضتين ضوئيتين 5 ثوان بفواصل 60 ثانية.

الجدول 1: تكوين محلول Ringer

حل Ringer الكاشف التركيز (مللي متر) كلوريد الصوديوم 130 كيه سي إل 2 مغنكلوريد₂ 5 كلوريد_{الهواء 2} 2 هيبس 10 معايرة الأس الهيدروجيني إلى 7.15 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: الأدوات والأجهزة اللازمة لتثبيت الذباب وتسجيل الماصة. (أ) نظام النوم ذبابة؛ (ب) دواسة نظام النوم الطيران؛ (ج) مصدر الضوء البارد؛ (د) المجهر المجسم؛ (ه) سخان خيوط الشمع. (و) لحام الحديد. (ز) دواسة سخان خيوط الشمع. (ح) ملاقط خشنة؛ (ط) حامل ذبابة مغناطيسي ؛ (ي) شمع منخفض درجة حرارة الانصهار. (ك) مناديل رقيقة؛ (L) مجتذب الماصة العمودي. (م) حقنة ذات طرف ممدود؛ (ن) حاملات الأقطاب الكهرب...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حقنة 1 مل بطرف ممدود الشكل 1 م 1 ملاقط خشنة دومون # 5 ، قياسي 0.1 مم × 0.06 مم ، الطول 110 مم ، Inox (الشكل 1H) 2 عدسات مكثف محول A / D الجهاز الجزيئي ديجي داتا 1200 الاستبدال المحتمل: أي بيانات رقمية من الأجهزة الجزيئية (على سبيل المثال 1440 أ) - الشكل 2 ج مكبر إلكترونيات مثالية تقريبا الاستبدال المحتمل: أدوات وارنر - IE251A أو IE-210 (يأتي مع مسرح الرأس) - الشكل 2 د طاولة مضادة للاهتزاز نيوبورت فولكس فاجن - 3036 - الأراضي الفلسطينية المحتلة - 01 الشكل 7H الشعيرات الدمويه جهاز هارفارد الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات 1 مم × 0.58 مم (الشكل 1O) كلامبكس الجهاز الجزيئي برمجيات خزان CO2 مصدر الضوء البارد شوت KL1500 LCD الشكل 1 ج مساحات حساسة كيمتيك Kimwipes (الشكل 1K) حامل القطب الكهربائي مناسب للعيار الشعري OD 1 مم (الشكل 1N والشكل 2N والشكل 2P) قفص فاراداي صنع منزلي حماية من الضوضاء الكهرومغناطيسية والستارة الأمامية السوداء (الشكل 2K) مرشح (ملون) شوت OG590 ، مرشح الحافة الشكل 2 ق مرشح (ملون) شوت BP450 / 40 نانومتر الشكل 2 ق مرشح (ملون) الحلل 550 نانومتر الشكل 2 ق مرشح (ملون) لمصدر الضوء البارد شوت الجهاز RG630 الشكل 1 ج فلتر (حرارة) شوت الروضة 3 الشكل 1 ق المرشحات (مرشح الكثافة المحايدة) صفاء 6،5،4،3،2،1،0.5،0.3 الشكل 2 ق نظام مصباح فلاش هانيويل الشكل 2U نظام نائم يطير مع حاقن حقن + ماتيك الشكل 1 أ-ب مزود طاقة المصباح الوكاله LPS-220 الشكل 2W كاشف الضوء صنع منزلي الترانزستور الضوئي (الشكل 2O) دليل الضوء قطر 3 مم ، طوله 1.3 متر (الشكل 2L ، M) مصدر الضوء مصباح زينون عالي الضغط وخالي من الأوزون بقدرة 75 واط (يعمل بقدرة 50 واط) ، الاستبدال المحتمل: أبحاث كيرن - OptoLED (الشكل 7R) شمع ذوبان درجة حرارة منخفضة صنع منزلي يتكون من خليط من شمع العسل (TM≈62 درجة مئوية) والبارافين عند ~ 3: 1 للوصول إلى درجة حرارة انصهار ~ 55-56 درجة مئوية (الشكل 6J) حامل مغناطيسي للذباب صنع منزلي الشكل 1I والشكل 2Q نظام مضخم القطب الكهربائي الدقيق مع مرحلة الرأس إلكترونيات مثالية تقريبا اختبار المعاوقة (الشكل 2G) مناور دقيق (ميكانيكي خشن) Tritech Research ، Narishige م -2 Micromanipulator (دقيقة ميكانيكية) Leitz Microsystems Leitz الميكانيكية Micromanipulator الشكل 2F بكلامب الجهاز الجزيئي برمجيات طبق بتري 60 ملم مولد النبض أمبي ماجستير 8 الشكل 2 أ كريم Redux لتخطيط كهربية القلب مختبرات باركر كريم الإلكتروليت Redux سائق الغالق يونيبليتز ، فنسنت أسوشيتس VCM-D1 أحادي القناة أحادي المستقر الشكل 2V نظام الغالق يونيبليتز ، فنسنت أسوشيتس LS2 مصاريع أحادية الثبات مقاس 2 مم الشكل 2V الأسلاك الفضية وارنر إنسترومنتس قطرها 0.25-1 مم ، تحتاج إلى الكلوريد مكواة لحام تتكون من خيوط البلاتين والإيريديوم قطر 0.25 مم (الشكل 2F) مجهر التكبير المجسم نيكون SMZ-2B الشكل 1 د مجهر التكبير المجسم البريه وايلد M5 مع إعدادات تكبير 6 و12 و25 و50 (الشكل 2E) مرشحات الحقنة ميليكس مرشح PVDF 22 ميكرومتر مجتذب الماصة العمودي سوتر / ناريشيجي الموديل P-97 / PP-830 استخدم إما مجتذبا رأسيا أو أفقيا ، حسب الرغبة (الشكل 1L) سخان خيوط الشمع صنع منزلي الشكل 1E-G نظام مصباح فلاش زينون الدكتور راب OptoElectronic جي إم إل سي 2 الشكل 2X