Method Article

تصور ورسم خرائط المسارات العصبية في شريحة دماغ اللوزة

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Bosch ، D. ، et al. Ex vivo التشريح البصري الوراثي لدوائر الخوف في شرائح الدماغ. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو إجراء لتحليل الاتصال المشبكي بين قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) والخلايا العصبية اللوزة باستخدام شرائح دماغ اللوزة الحادة من الفئران. تعبر الخلايا العصبية mPFC في هذه الفئران عن قناة رودوبسين مدمجة في بروتين فلورسنت. تسهل القناة رودوبسين تدفق الأيونات وتوليد جهد الفعل في الخلايا العصبية mPFC عند تنشيط الضوء. وبالتالي ، تطلق الخلايا العصبية mPFC ناقلات عصبية ترتبط بالخلايا العصبية للوزة بعد المشبكي ، مما يؤدي إلى تيارات ما بعد المشبكي التي يتم تسجيلها لتصور اتصال اللوزة mPFC-amygdala.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

فئة

1. تصور وتحفيز الألياف قبل المشبكية

  1. تحضير مجهر التصحيح للتنشيط البصري الوراثي للألياف والخلايا:
    1. قم بتوسيط الصمام الثنائي الباعث للضوء المركب (LED) على مسار توصيل الضوء.
    2. قم بقياس شدة ضوء LED في المستوى البؤري الخلفي وعند إخراج كل هدف باستخدام مقياس طاقة لاختيار الطول الموجي المناسب البالغ 470 نانومتر.
    3. احسب شدة الضوء بالميغاواط / مم2 وقم بإنشاء منحنى معايرة (شدة LED (٪) مقابل ناتج الضوء (ميغاواط / مم2)) لكل هدف للقيم المقاسة للطول الموجي 470 نانومتر.
  2. استرجع شريحة اللوزة الحادة من حجرة الواجهة وضعها في حجرة الشريحة المثبتة على المجهر المستقيم المزود بمصباح فلورسنت. احرص على وضع الشريحة بحيث يكون سطح الشريحة المواجه لأعلى في حجرة الواجهة متجها أيضا لأعلى في غرفة التسجيل. شريحة النفخ مع السائل النخاعي الاصطناعي الطازج المؤكسج (ACSF) بمعدل 1-2 مل / دقيقة عند درجة حرارة ~ 31 درجة مئوية.
  3. راقب الألياف قبل المشبكية في الشريحة باستخدام مصباح الفلورسنت مع مجموعات المرشحات المناسبة للبروتين الفلوري المحدد المعبر عنه. استخدم هدف 5x للحصول على نظرة عامة (الشكل 1E) ، وهدف 60x لتقييم كثافة الألياف داخل المنطقة المستهدفة.
    ملاحظة: بالنسبة إلى GFP و YFP ، استخدم مجموعة المرشحات "الأخضر" (الإثارة 472/20 ، Beamsplitter 495 ، Emission 490 LP) لمجموعة مرشحات استخدام mCherry "أحمر" (الإثارة 560/40 ، Beamsplitter 585 ، الانبعاثات 630/70) كما هو محدد في جدول المواد / المعدات.
  4. افتح أو قم بتقييد الفتحة في مسار ضوء المجهر حسب الرغبة للتجربة (الشكل 2 د).
  5. للحصول على تسجيل رقعة، املأ ماصة التصحيح بمحلول داخلي وقم بتثبيتها في حامل القطب. ضع ضغطا إيجابيا على ماصة الرقعة وخفضها ببطء أولا في محلول الحمام ثم تحت التحكم البصري في الشريحة باستخدام أداة المعالجة الدقيقة.
    1. اقترب من الخلايا العصبية ذات الأهمية باستخدام ماصة التصحيح من الجانب والأعلى. حرر ضغطا إيجابيا عندما تكون الماصة على سطح الخلية (الغمازة مرئية على سطح الخلية) واحصل على "جيجاسيل" عن طريق الضغط السلبي.
    2. قم بتطبيق مزيد من الشفط لتمزيق رقعة الغشاء للحصول على تسجيل الخلية بالكامل. بعد ذلك ، قم بتحفيز الألياف المصنفة باستخدام مؤشر LED المتصل باستخدام الطول الموجي المناسب لتنشيط القناة رودوبسين (ChR) (470 نانومتر) أثناء تسجيل الاستجابات الكهربائية من الخلية.
    3. للتحفيز المشبكي ، ابدأ بكثافة LED منخفضة وقم بزيادتها حتى يتم الوصول إلى سعة التيار المشبكي المطلوبة. قم بتشغيل مؤشر LED عن طريق تكوين المخرجات الرقمية في برنامج الحصول على البيانات للتحكم في التوقيت وطول النبضة (أمثلة في الشكل 3).
      ملاحظة: يمكن استخدام برامج أخرى و / أو أجهزة إنشاء TTL لتشغيل LED.
  6. كرر التحفيز بفتحة مفتوحة أو مقيدة (الخطوة 1.4) في مسار ضوء المجهر حسب الرغبة للخلية المسجلة التالية و / أو في وجود أدوية معينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. الحقن التجسيمية ، وإعداد شرائح الدماغ الحادة ، وتصور الألياف قبل المشبكي. (أ ، ب) حقن الفيروسات التجسيمية. أ) صورة فأر مخدر موضوعة في إطار تجسيمي مع كشوف الجمجمة وماصة الحقن. الداخل: تكبير صورة ماصة الحقن المملوءة بمحلول الفيروسات الممزوج باللون الأخضر السريع. شريط المقياس: 3 مم. (ب) تخطيطي لجمجمة الفأر مع مواضع محددة لثقوب الحفر لمناطق الحقن المخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (ACSF) للتكوين ، انظر المراجع # 16 و # 23 حلول التصحيح الداخلي للتكوين ، انظر المراجع # 16 و # 23 كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات Roth, ألمانيا P027.1 تحضير محلول مخزون 2M في الماء النقي مجسم ، SZX2-RFA16 أوليمبوس ، اليابان مصباح الفلورسنت Xcite (XI120Q-1492) مجموعة Lumen Dynamics ، كندا 2012-12699 مجهر التصحيح ، BX51WI أوليمبوس ، اليابان مكبر للصوت متعدد المشبك 700B الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية ديجيت داتا 1440 أ الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية برنامج PClamp ، الإصدار 10 الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية تستخدم للتحكم في الحصول على البيانات وتحفيزها جهاز التحكم في درجة حرارة الحمام ، TC05 لويجز ونيومان ، ألمانيا 200-100 500 0145 ثلاثة محاور micromanipulator ميني 25 لويجز ونيومان ، ألمانيا 210-100 000 0010 وحدة تحكم Micromanipulator SM7 لويجز ونيومان ، ألمانيا 200-100 900 7311 الشعيرات الدموية الزجاجية للماصات الرقعة العالمية للأدوات الدقيقة ، ألمانيا جيجابايت 150 إف - 8 ف ورق ترشيح نترات السليلوز لغرفة الواجهة Satorius Stedim Biotech ، ألمانيا 13006--50----ACN وحدة LED ، CoolLED pE CoolLED، المملكة المتحدة 244-1400 يعد CoolLED أو USL 70/470 والمحولات المناسبة خيارين بديلين لتحفيز LED CoolLED 100 مزدوج التكيف CoolLED، المملكة المتحدة محول الطاقة عبر الطاقة 50E وحدة LED ، USL 70/470 راب إلكترونية بصرية L70-000 محول ثنائي المنفذ راب إلكترونية بصرية استفسر من الشركة مجموعة المرشح باللون الأحمر (الإثارة) AHF ، ألمانيا F49-560 يمكن شراء المرشحات على أنها مجموعة F46-008 (شعاع الشعاع) AHF ، ألمانيا F48-585 (انبعاث) AHF ، ألمانيا F47-630 مجموعة المرشح باللون الأخضر (الإثارة) AHF ، ألمانيا F39-472 البدائل: مجموعة الترشيح F36-149 أو F46-002 (مع انبعاث ممر النطاق) (شعاع الشعاع) AHF ، ألمانيا F43-495W (انبعاث) AHF ، ألمانيا F76-490 LaserCheck، عداد الطاقة المحمول باليد متماسك، الولايات المتحدة الأمريكية 1098293 برنامج IgorPro ، الإصدار 6 Wavemetrics ، الولايات المتحدة الأمريكية لتحليل بيانات الفيزيولوجيا الكهربية ، يمكن أيضا استخدام حزم برامج بديلة أخرى مجموعة عصبية من وحدات الماكرو ل IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amygdala Brain SlicemPFC Amygdala ConnectivityChannelrhodopsin ActivationOptogenetic DissectionPatch Clamp RecordingFluorescence MicroscopyLED Light CalibrationPostsynaptic Current AnalysisFear Circuit MappingSynaptic Connectivity Visualization

Related Articles