تسجيل مخطط كهربية الشبكية والإمكانات البصرية المستحثة في الفئران

الملخص

المصدر: Charng، J. et al. زرع وتسجيل مخطط كهربية الشبكية اللاسلكي والإمكانات المرئية المستحثة في الفئران الواعية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو كيفية تسجيل مخطط كهربية الشبكية (ERG) والجهد البصري المستحث (VEP) في فأر واعي. الجرذ ، مع أقطاب كهربائية مزروعة جراحيا ، يتكيف أولا مع الظلام. بعد وضع قطرات متوسعة ، يتم وضع في مصفاة ووضعه في وعاء Ganzfeld. ثم يتم تسجيل إشارات ERG و VEP.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الأقطاب

الكهربائية

ملاحظة: يتم استخدام جهاز إرسال ثلاثي القنوات للزرع الجراحي ، والذي يتيح إجراء مخطط كهربية الشبكية (ERG) وتسجيل جهد بصري واحد (VEP) في وقت واحد. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية الثلاثة النشطة والثلاثة غير النشطة مصممة مسبقا في شكل حلقة قبل الزرع من أجل التصاق بالعين. لأغراض تحديد الهوية ، قامت الشركة المصنعة بإحاطة أقطاب كهربائية نشطة بأغلفة بلاستيكية نصف بيضاء ونصف ملونة ، بينما يتم تغطية الأقطاب الكهربائية غير النشطة بأغلفة كاملة الألوان. يتم ترك القطب الأرضي (غلاف بلاستيكي شفاف) دون تغيير لجميع الأقطاب الكهربائية النشطة وغير النشطة لإجراء الخطوات 1.1 و 1.2 و 1.3 و 1.7.

1. قم بفك القطب الكهربائي المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ مزدوج الشريطة باستخدام كماشة ذات رؤوس دقيقة.
2. قم بقص أحد خيوط الفولاذ المقاوم للصدأ (حوالي 1 سم من الحافة) ، مع ترك خيط مستقيم أطول متبقي لتشكيل القطب الدائري.
3. قم بطي الخصلة المفردة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ مرة أخرى على نفسها ولفها ، لتشكيل حلقة ناعمة عند طرف القطب.
4. بالنسبة للأقطاب الكهربائية النشطة ERG ، قم بتصميم هذه الحلقة بقطر ~ 0.2 - 0.5 مم عن طريق لف قاعدة الحلقة (للغرض الموضح هنا ، قم بتشكيل قطبين نشطين بهذه الطريقة لتسجيل ERG من كلتا العينين) ، وبالنسبة لأقطاب ERG غير النشطة و VEP ، تجعل قطر الحلقة ~ 0.8 مم (في هذا المثال ، افعل ذلك لقطب VEP نشط واحد وجميع الأقطاب الكهربائية الثلاثة غير النشطة).
5. قم بربط القطب النشط الدائري VEP حول برغي من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطره 0.7 مم ، طول 3 مم) بحيث يستقر القطب على رأس المسمار.
6. قم بربط 3 أقطاب كهربائية غير نشطة (2 ERG ، 1 VEP) حول برغي ثان من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 0.7 مم ، طول 3 مم).
7. اسحب الغلاف البلاستيكي للأمام فوق الأطراف الحادة للخيطين المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتقليل التهيج.
8. قم بتعقيم أجهزة إرسال القياس عن بعد عن طريق نقعها في 2٪ جلوتارالديهايد لأكثر من 10 ساعات عند 25 درجة مئوية تقريبا. ثم اشطف جهاز الإرسال بمحلول ملحي معقم ثلاث مرات.

فئة

2. زرع جهاز الإرسال

1. تحضير
   1. تطهير المنطقة الجراحية قبل التجربة عن طريق تنظيفها بنسبة 70٪ من الإيثانول. الأوتوكلاف جميع المعدات الجراحية قبل الاستخدام وصيانة المعدات في الكلورهيكسيدين عندما لا تكون قيد الاستخدام أثناء الجراحة. قم بتغطية بستارة جراحية أثناء الجراحة للحفاظ على بيئة معقمة. تأكد من ارتداء جميع المجربين للأقنعة الجراحية والقفازات المعقمة والعباءات.
   2. تحفيز التخدير ب 1.5 - 2٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق 3 لتر / دقيقة والحفاظ عليه عند 1.5 - 2٪ عند 2 لتر / دقيقة طوال الجراحة. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود منعكس دواسة عند الضغط على العضلة بين أصابع القدم.
   3. حلق مساحة 40 مم × 30 مم فوق البطن من فوق الفخذ إلى القص.
   4. حلق مساحة 30 مم × 20 مم فوق الجبهة وخلف العينين وأمام الأذنين.
   5. تطهير المنطقتين المحلوقتين. بالنسبة لمنطقة الجبهة ، يجب تطهير 10٪ من بوفيدون - اليود ثلاث مرات (تجنب استخدام المطهرات التي تحتوي على الكحول للمنطقة القريبة من العين ، بما يتفق مع معيار الممارسة الذي وضعته جمعية تقنيي الجراحة). على البطن ، تطهير ب 10٪ بوفيدون اليود و 70٪ إيثانول.
   6. ضع قطرة واحدة من بروكسي ميتاكائين على القرنية للحصول على تخدير موضعي إضافي.
   7. ضع قطرة واحدة من كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القرنية لمنع جفاف العينين.
2. الزرع الجراحي
   1. قم بعمل شق 10 مم على الرأس على طول خط الوسط العمودي بين الأذنين بمشرط جراحي.
   2. قم بعمل شق 5 مم في البطن من خلال طبقة الجلد على طول خط الوسط أسفل القص.
   3. نفق قنية قطرها 5 مم تحت الجلد من شق البطن إلى شق الرأس.
   4. قم بتغذية أسلاك القطب الكهربائي (3 نشطة و 3 غير نشطة) لجهاز الإرسال من خلال القنية من البطن إلى الرأس.
   5. اترك القطب المرجعي مع قاعدة جهاز الإرسال وقم بتغطية طرف القطب بشاش معقم.
   6. قم بتغطية أطراف القطب الكهربائي (3 نشطة و 3 غير نشطة) بشاش معقم.
   7. قم بتأمين رأس الفئران في منصة تجسيمية.
   8. مد شق الجبهة إلى 30 مم بطول المقص الجراحي.
   9. كشف المنطقة الجراحية عن طريق سحب الجلد المترهل باستخدام خيوط (3 - 0) عند ~ 3 و 9.
   10. اكشط السمحاق الذي يغطي الجمجمة باستخدام شاش معقم لكشف خيوط بريجما ولادا وخط الوسط.
   11. قم بحفر فتحتين من خلال الجمجمة في VEP نشط (7 مم بطني إلى بريجما ، 3 مم جانبي إلى خط الوسط) وغير نشط (5 مم منقاري إلى بريجما على خط الوسط).
   12. قم بتوصيل أقطاب VEP النشطة وغير النشطة ببراغي من الفولاذ المقاوم للصدأ متصلة مسبقا (قطر 0.7 مم ، طول 3 مم) بالجمجمة باستخدام مفك براغي صغير يصل عمق ~ 1 مم إلى الفتحات المعدة مسبقا. هذا يثبت المسمار على العظم دون الإضرار بالأنسجة القشرية الأساسية.
   13. لزرع أقطاب ERG النشطة ، استخدم خياطة 8 - 0 لسحب الجفن العلوي مؤقتا.
   14. أدخل قنية من 16 إلى 21 جم تحت الجلد من خلف العين إلى قبو الملتحمة العلوي.
   15. قم بإزالة الإبرة التوجيهية.
   16. قم بتغذية القطب النشط من خلال القسطرة البلاستيكية المختصرة من الجبهة باتجاه العين. ثم قم بإزالة القسطرة البلاستيكية.
   17. استخدم خياطة مؤقتة (8 - 0) ، يتم تمريرها عبر حلقة القطب ، لمنع القطب من التراجع مرة أخرى إلى النفق.
   18. قم بعمل شق 0.5 مم على الملتحمة العلوية عند موضع الساعة 12 ، 1 مم خلف الطرف. استخدم تشريحا حادا لكشف الصلبة الكامنة.
   19. زرع خياطة 8 - 0 أو 9 - 0 خلف الطرف مباشرة بنصف سمك صلبي.
   20. قم بإزالة الخيط المؤقت من القطب النشط ERG.
   21. قم بتثبيت القطب النشط ERG على خياطة نصف سمك الصلبة عن طريق ربط 3 عقدة متتالية ، مما يضمن وضع طرف القطب بالقرب من الطرف.
   22. أغلق رفرف الملتحمة باستخدام 1 إلى 2 خيوط متقطعة (8 - 0 إلى 9 - 0). تأكد من أن الملتحمة تغطي قطب ERG بالكامل لتحسين الراحة.
   23. قم بإزالة خياطة سحب الجفن.
   24. كرر الإجراء للعين المقابلة.
   25. ضع جل سيانوا أكريليت على الجمجمة لتأمين جميع البراغي غير القابل للصدأ وأسلاك القطب. تأكد من عدم سحب الأقطاب الكهربائية النشطة ERG بإحكام شديد قبل تثبيتها لتمكين حركات العين.
   26. أغلق جرح الرأس باستخدام خياطة غير قابلة للامتصاص 3-0.
   27. قم بتدوير القوارض لفضح منطقة البطن. قم بإطالة شق جلدي البطن إلى 40 مم على طول Linea alba باستخدام مقص جراحي.
   28. قم بعمل شق 35 مم عبر جدار العضلات الداخلي لكشف تجويف البطن الداخلي.
   29. باستخدام خيوط (3-0) ، يتم توصيل جسم الإرسال بجدار البطن الداخلي الأيمن للحيوان. تجنب ملامسة الكبد.
   30. قم بلف القطب الأرضي وثبته بهذا الشكل باستخدام خياطة (3 - 0). ثم ضعه يطفو بحرية في تجويف البطن.
   31. أغلق الصفاق باستخدام خياطة مستمرة (3 - 0).
   32. أغلق شق الجلد باستخدام الغرز المتقطعة (3 - 0).
3. رعاية ما بعد الجراحة
   1. راقب حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الرقة القصية. ضع منفردا بعد الجراحة.
   2. يتم تطبيق الكاربروفين تحت الجلد لعلاج التسكين (5 ملغ/كغ) مرة واحدة يوميا لمدة 4 أيام.
   3. إضافة المضادات الحيوية الوقائية عن طريق الفم (إنروفلوكسين ، 5 مجم / كغ) إلى مياه الشرب لمدة 7 أيام بعد الجراحة.
   4. ضع مرهما مضادا للالتهابات على مواقع شق الجلد لتقليل التهيج خلال أول 7 أيام بعد الجراحة.

< p class = "jove_title" >3. إجراء تسجيلات ERG و VEP في الفئران الواعية

1. التكيف المظلم لمدة 12 ساعة قبل تسجيلات ERG و VEP.
2. إجراء جميع عمليات التلاعب التجريبية تحت إضاءة حمراء خافتة (17.4 شمعة في م-2 ، λmax = 600 نانومتر)
3. تطبيق قطرات التخدير الموضعي (0.5٪ بروكسي ميتاكايين) وتوسيع قطرات (0.5٪ تروبيكاميد) على القرنية.
4. قم بتوجيه القوارض الواعية إلى تقييد واضح ومصنوع حسب الطلب.
   ملاحظه: يمكن تعديل طول هذا الأنبوب البلاستيكي لاستيعاب الفئران ذات الأحجام المختلفة ، مع تثبيت القطر الكلي عند 60 مم. الواجهة الأمامية للجهاز مدببة لتقليل حركة الرأس وتحتوي على ثقوب لتمكين التنفس الطبيعي. تسمح هذه الجبهة المدببة بمحاذاة رأس الفئران وعينيه وتثبيتها لفتح كرة Ganzfeld. لاحظ أن القوارض قد تأقلمت مع التقييد (من 3 إلى 5 مناسبات) قبل الجراحة.
5. ضع القوارض أمام وعاء Ganzfeld مع محاذاة العينين مع فتحة الوعاء.
6. قم بتشغيل جهاز الإرسال السكني عن طريق تمرير مغناطيس في حدود ~ 5 سم منه. بعد ذلك، تحقق من تشغيل جهاز الإرسال عن طريق التحقق من ضوء حالة LED على قاعدة جهاز الاستقبال.
7. اجمع الإشارات عبر مجموعة من الطاقات المضيئة (على سبيل المثال ، -5.6 إلى 1.52 log cd.s.m²).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكبر للصوت الحيوي أدينسيرومنتس مل 135 تضخيم إشارات ERG و VEP كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم 1.0٪ اليرجان سجل المستخلصات الكيميائية 0009000-11-7 الحفاظ على ترطيب القرنية أثناء الجراحة كاربروفين 0.5٪ مجموعة فايزر لصحة كياس 53716-49-7 تسكين ما بعد الجراحة، مع محلول ملحي عن طريق الحقن لتجديد السوائل كلورهيكسادين 0.5٪ مختبرات أوريون 27411 ، 80085 تطهير الأدوات الجراحية منشط جل سيانواكريليت مكونات RS 473-439 يجفف جل سيانواكريليت بسرعة جل سيانوكريليت مكونات RS 473-423 إصلاح مسامير غير قابلة للصدأ على الجمجمة لدغ الأسنان Storz Instruments و Bausch و Lomb E0824A رأس حفر مصغر بقطر ~ 0.7 مم لعمل ثقب صغير في الجمجمة فوق كل نصف كرة لزرع مسامير VEP نقب بوش سلسلة Dremel 300 مثقاب أوتوماتيكي للنقب إنروفلوكسين مختبرات تروي المضادات الحيوية الوقائية بعد الجراحة Ganzfeld دمج المجال الحلول الضوئية الدولية محفز الضوء المصمم خصيصا: قطر 36 مم ، حجم فتحة 13 سم مسحات الشاش Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100 ب يجفف الشق الجراحي وسطح الجمجمة المكشوف أثناء الجراحة إيزوفلوران 99.9٪ أبوت أستراليا بي تي واي المحدودة سجل المستخلصات الكيميائية 26675-46-7 اسم الملكية: Isoflo (TM) التخدير الاستنشاقي. مخدر استنشاقي من الدرجة الصيدلانية ممزوج بغاز الأكسجين لجراحة زرع القطب الكهربائي VEP مرهم Kenacomb أسبن فارما بي تي واي المحدودة لتقليل تهيج الجلد والحكة بعد الجراحة مصابيح Luxeon LED شركة فيليبس للإضاءة لتحفيز الضوء ، عشرون 5 واط وواحد 1 واط LED ، يتم التحكم فيه بواسطة برنامج Scope إبرة (جراحة كبيرة) أدوات الدقة العالمية 501959 لخياطة جراحة البطن والرأس ، تستخدم مع خياطة 3-0 ، إبرة العين ، حافة القطع دائرة 5/16 مقاس 1 ، 15 مم حامل إبرة (جراحة كبيرة) أدوات الدقة العالمية 500224 لحمل الإبرة أثناء جراحة البطن والرأس حامل إبرة (الجراحة المجهرية) أدوات الدقة العالمية 555419NT لحمل الإبرة أثناء جراحة العين قسطرة أوبتيفا سميثس الطبية الدولية المحدودة 16 أو 21 جرام توجيه الأقطاب الكهربائية النشطة للقرنية من الجمجمة إلى الملتحمة بوفيدون اليود 10٪ سانوفي أفينتيس سجل المستخلصات الكيميائية 25655-41-8 الاسم الخاص: بيتادين ، مطهر لتحضير الجلد المحلوق للجراحة 10٪ ، 500 مل نظام الحصول على البيانات Powerlab أدينسيرومنتس مل 785 الحصول على إشارة من جهاز إرسال القياس عن بعد ، مقترن بمحول بيانات القياس عن بعد بروكسي ميتاكايين 0.5٪ مختبرات ألكون كيان 5875-06-9 تسكين العين الموضعي تقييد صنع cutom الجزء الأمامي من التقييد مدبب لتقليل حركة الرأس ، ويمكن تعديل الطول لاستيعاب طول الفئران المختلف ، والقطر الكلي 60 مم. شفرة سكيبل ر.ج. المستلزمات الطبية SNSM0206 للشق الجراحي مقص (جراحة ماكنية) أدوات الدقة العالمية 501225 لقطع الأنسجة على abodmen والرأس مقص (الجراحة المجهرية) أدوات الدقة العالمية 501232 لتشريح الملتحمة لربط القطب الكهربائي برنامج النطاق أدينسيرومنتس الإصدار 3.7.6 يقوم في نفس الوقت بتشغيل التحفيز عبر نظام ADI Powerlab وجمع البيانات ماكينه حلاقه اوستر ذهبي A5 حلق الفراء من المناطق الجراحية مسامير streel غير القابل للصدأ السحابات الدقيقة L001.003CS304 قطر العمود 0.7 مم ، طوله 3 مم إطار تجسيمي ديفيد كوبف نموذج 900 أداة تجسيمية حيوانية صغيرة لتحديد معالم الزرع على الجمجمة الستارة الجراحية المستلزمات الطبية الحيوية GM29-612EE ضمان بيئة معقمة أثناء الجراحة خياطة (جراحة كبيرة) إبر نينبو الطبية 3-0 لخياطة جراحة البطن والرأس ، حرير معقم مضفر ، 60 سم إبرة خياطة (جراحة مجهرية) إبر نينبو الطبية 8-0 أو 9-0 لجراحة العين بما في ذلك خياطة القطب الكهربائي للصلبة وإغلاق جرح الملتحمة ، خياطة النايلون ، 3/8 دائرة 1×5 ، 30 سم محول بيانات القياس عن بعد علوم البيانات الدولية التوصية 08 يسمح لإشارة القياس عن بعد بالتفاعل مع برنامج جمع البيانات مصفوفة تبادل بيانات القياس عن بعد علوم البيانات الدولية يجمع البيانات من أجهزة الإرسال ، يقترن بجهاز الاستقبال مستقبل بيانات القياس عن بعد علوم البيانات الدولية RPC-1 يستقبل بيانات القياس عن بعد من جهاز الإرسال جهاز إرسال القياس عن بعد علوم البيانات الدولية F50-EEE 3 قنوات الارسال عن بعد تروبيكاميد 0.5٪ مختبرات ألكون تمدد القزحية ملاقط (جراحة كبيرة) أدوات الدقة العالمية 500092 معالجة الأنسجة أثناء جراحة البطن والرأس ملاقط (جراحة مجهرية) أدوات الدقة العالمية 500342 معالجة الأنسجة أثناء جراحة العين