تسجيل تخطيط كهربية الدماغ لنوبات الصرع في الفئران الناجمة عن الصرع

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تجميع جهاز مسبار الغسيل الكلوي المجهري

1. استخدم قطبا كهربائيا ملتويا من 3 قنوات (بطول قطع 20 مم على الأقل لقطب التسجيل وقطب تأريض بطول 10 سم) وقم بإقرانه بقنية توجيه لإعداد الجهاز. انظر أمثلة على الأقطاب الكهربائية ذات 3 قنوات وقنية التوجيه لغسيل الكلى في الشكل 1A-1B.
2. قم بإزالة (الشكل 1 ج) وأدخل (الشكل 1 د) قنية التوجيه المعدنية في القنية البلاستيكية الوهمية عدة مرات قبل الاستخدام لتسهيل إزالتها في لحظة تحولها لمسبار غسيل الكلى المجهري في.
3. قم بثني الأسلاك الملتوية لتسجيل قطب القطب مرتين (الشكل 1E-1F) من أجل محاذاة الأسلاك مع القنية الوهمية للدليل وقطع طرف القطب الكهربائي (الشكل 1G) ليكون أطول بمقدار 0.5 مم من طرف قنية التوجيه (الشكل 1H) باستخدام الفرجار الرقمي.
4. جهز دائرة السيليكون بطول 1 مم (القطر الخارجي [OD] 2 مم ، سمك 0.3 مم ؛ الشكل 1I) وأدخل طرف قنية التوجيه وطرف الأقطاب الكهربائية الملتوية في دائرة السيليكون باستخدام الملقط (الشكل 1J). قم بتثبيته على سفح قاعدة قنية التوجيه بغراء بوليمر سريع المفعول أو الراتنج (الشكل 1K). انظر مثال الأجهزة المكتملة في الشكل 1L والشكل 2 أ.
قم
5. بتعقيم الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم (UV) لمدة 4 ساعات. اقلب الجهاز أربع مرات بحيث يتعرض كل جانب من جوانبه للضوء لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: يمكن تجميع العديد من الأقطاب الكهربائية محلية الصنع ومجسات غسيل الكلى المجهري بطريقة مماثلة. رأس الغرسة الموصوفة أعلاه للفئران له الأبعاد التالية: عرض 7 مم × عمق 5 مم × طول 10 مم من أعلى إلى إصبع القدم ؛ يبلغ طول طرف الغرسة حوالي 11 مم وقطره 600 ميكرومتر ويبلغ وزن جميع الأجهزة حوالي 330-360 مجم. يمكن إعادة استخدام الجهاز مرتين أو ثلاث مرات إذا (1) ترك طول كاف من القطب الأرضي على الجمجمة أثناء الجراحة للاستخدام التالي و (2) عندما يقتل ، ويستعيد الجهاز مع أسمنت الأسنان ، يترك في الأسيتون طوال الليل ، بحيث يمكن فصل الأسمنت ميكانيكيا ، وغسل الجهاز وتعقيمه مرة أخرى.

1. استخدم جهازا تجسيميا وحامل مشبك مسبار (الشكل 2 ب) لزرع الجهاز وفقا للمعايير المعاصرة للجراحات المعقمة والخالية من الألم.
   1. قم بتخدير فئران Sprague-Dawley البالغة بخليط الكيتامين / الزيلازين (43 مجم / كجم و 7 مجم / كجم ، داخل الصفاق [IP]) وتثبيته على الإطار التجسيمي. أضف تخدير الأيزوفلوران (1.4٪ في الهواء ؛ 1.2 مل / دقيقة) إلى حقن الكيتامين / الزيلازين الأولي لأنه يسمح بالتحكم في عمق التخدير في الوقت المناسب. احلق الفراء على رأس.
2. امسح سطح جلد الرأس بمحلول قائم على اليود متبوعا ب 70٪ إيثانول لتحضيره للجراحة المعقمة.
   1. زرع جهاز قنية التوجيه المحضرة بالأسبقية (1.1 - 1.5) في الحصين البطني الأيمن باستخدام الإحداثيات التالية: قضيب الأنف + 5.0 مم ، A - 3.4 مم ، L + 4.5 مم ، P + 6.5 مم إلى bregma. اتبع التقنيات القياسية للجراحات التجسيمية.
   2. تأكد من أنه لا يغطي مسامير التثبيت. عند تركيبه على الجهاز التجسيمي ، أمسك الجهاز الخاص برأس قنية التوجيه حيث يمكن محاذاة ذلك بسهولة مع حامل المسبار.
3. قم بتثبيت الجهاز على الجمجمة باستخدام أربعة مسامير غير قابلة للصدأ على الأقل لتثبيتها في عظم الجمجمة (1 برغي في اليسار و 1 برغي في صفائح العظام الأمامية اليمنى ، وبرغي واحد في الجدارية اليسرى و 1 برغي في ألواح العظام بين الجدارية). أضف قطرة من غراء المناديل لتثبيت كل برغي في عظم الجمجمة.
   1. قم بتغطية نصف الخيوط اللولبية بأسمنت الميثاكريليك. تعزيز ارتباط الأسمنت عن طريق عمل أخاديد ضحلة في العظم لزيادة الالتصاق.
4. بمجرد وضع طرف الجهاز في أنسجة المخ ، قم بلف سلك القطب الأرضي حول 3 مسامير تثبيت. قم بتغطية جميع البراغي المثبتة والجهاز بأسمنت الأسنان.
5. راقب أثناء الجراحة ولمدة ساعة بعد ذلك حتى تصبح منتصبة وتتحرك حول القفص. احتفظ بها على وسادة تسخين لتجنب انخفاض حرارة الجسم. اسمح للفئران بالتعافي لمدة 7 أيام على الأقل بعد زرع الجهاز.
6. راقب مرة واحدة على الأقل يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات الألم أو الضيق. إعطاء مع كريم المضادات الحيوية (جنتاميسين 0.1٪) بالقرب من الموقع المقطوع للوقاية من العدوى ومسكن (ترامادول 5 مجم / كجم ، IP) لمدة 3 أيام لمنع ألم ما بعد الجراحة.

3. تحريض صرع الفص الصدغي بواسطة بيلوكاربين وتعيين للمجموعات التجريبية

1. بعد أسبوع من التعافي بعد الجراحة ، قم بتعيين بشكل عشوائي إلى مجموعات: (1) التي تتلقى السيارة و (2) المصابة بالصرع التي ستتلقى بيلوكاربين. استخدم عددا أكبر نسبيا من لمجموعة الصرع حيث لن تصاب جميع الفئران التي تعطى بالبيلوكاربين بالمرض.
2. حقن جرعة من ميثيل سكوبولامين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد [s.c.]) وبعد 30 دقيقة، حقنة واحدة من بيلوكاربين (350 ملغ/كغ، IP) للحث على حالة الصرع (SE). حقن ميثيل سكوبولامين والمركبة (المحلول الملحي) لفئران التحكم. استخدم حقنة 1 مل مع إبرة 25G لجميع إدارات IP.
   1. تحقق بصريا من لتبدأ في الإصابة بنوبات سلوكية (تحريك الاهتزاز في غضون 5 دقائق ، إيماءة الرأس ، استنساخ الأطراف) وفي غضون 25 دقيقة لاستنساخ كل الجسم بشكل مستمر (SE).
3. القبض على SE 2 ساعة بعد البداية ليكون معدل الوفيات حوالي 25٪ ومتوسط فترة كامنة من حوالي 10 أيام عن طريق إعطاء الديازيبام (20 ملغ/كغ, i.p.). راقب وسجل أي سلوك نوبة يبدأ مباشرة بعد حقن البيلوكاربين واستمر لمدة 6 ساعات على الأقل بعد ذلك.
4. أعط محلول ملحي (1 مل ، IP) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25G ومحلول سكروز (1 مل ، ص) باستخدام حقنة 1 مل وإبرة تغذية مرنة 17G لمدة 2-3 أيام بعد SE لتعزيز استعادة فقدان وزن الجسم.
   1. استبعاد التي لا تحقق وزن الجسم الأولي خلال الأسبوع الأول بعد بيلوكاربين SE من الدراسة (باستثناء المجموعة الحادة التي قتلت بعد 24 ساعة من SE ، حيث لا يمكن متابعة وزن الجسم).
5. قم بتعيين ما بعد SE بشكل عشوائي لمجموعات تجريبية مختلفة (الشكل 3): المرحلة الحادة (حيث يتم غسيل الكلى المجهري بعد 24 ساعة من SE) ، والكمون (7-9 أيام بعد SE) ، والنوبة العفوية الأولى (حوالي 11 يوما بعد SE) ، والدورة المزمنة (تبدأ حوالي 22-24 يوما بعد SE ، أي بعد حوالي 10 أيام من النوبة الأولى). مراقبة لحدوث النوبات التلقائية.
   ملاحظه: استخدام معايير الإدراج / الاستبعاد التالية لمزيد من التجارب على الفئران المصابة بالصرع: تطوير SE المتشنج في غضون ساعة واحدة بعد إعطاء بيلوكاربين. زيادة الوزن في الأسبوع الأول بعد SE والوضع الصحيح لمسبار غسيل الكلى المجهري والقطب.

4. مراقبة وتحليل سلوك الصرع

1. مراقبة طويلة الأمد لسلوك الصرع
   1. بعد حوالي 6 ساعات من إعطاء بيلوكاربين (أي في نهاية الملاحظة المباشرة من قبل الباحثين) ، ضع في أقفاص المنزل النظيفة وابدأ مراقبة الفيديو لمدة 24 ساعة.
   2. استمر في مراقبة الفيديو لمدة 24 ساعة حتى اليوم 5, باستخدام نظام المراقبة بالفيديو الرقمي.
   3. بدءا من اليوم 5 ، قم بتوصيل الفئران في أقفاص مستطيلة منزلها بنظام تسجيل مخطط كهربية الدماغ المربوط واستمر في مراقبة الفيديو على مدار 24 ساعة.
   4. اضبط المعلمات على مكبر الصوت الموجود خارج قفص فاراداي (اضبط عامل التضخيم على كل قناة وفقا لخصوصية إشارة مخطط كهربية الدماغ لكل على حدة) وابدأ اكتساب مخطط كهربية الدماغ مع مراعاة إشارة مخطط كهربية الدماغ التي تنتجها الكابلات غير المتصلة. استخدم معدل أخذ العينات 200 هرتز ومرشح التمرير المنخفض مضبوطا على 0.5 هرتز.
   5. قم بتوصيل بالكابلات التي تمسك برأس بين إصبعين ممدودين من يد واحدة وقم بربط الموصلات بقاعدة القطب باستخدام اليد الحرة الأخرى. ابدأ عملية الاستحواذ.
      أنذر: تأكد من خلو الإشارة من القطع الأثرية. القطع الأثرية الشائعة هي مسامير تتجاوز المقياس بشكل كبير.
   6. قبل يوم واحد من تجربة غسيل الكلى المجهري ، انقل إلى نظام مخطط كهربية الدماغ المربوط المجهز بأسطوانات زجاجية شبكية لغسيل الكلى المجهري. افصل عن نظام ربط مخطط كهربية الدماغ في قفص المنزل ، مما يؤدي إلى شد الموصلات من القطب دون كبح جماح. ضع في أسطوانات زجاج شبكي عالية.

الشكل 1. التحضير خطوة بخطوة للجهاز المراد زرعه. (أ) قطب كهربائي ثلاثي القنوات مع قطب تأريض بطول 10 سم في غلافه الواقي على اليسار وقنية توجيه لغسيل الكلى المجهري على اليمين اللازمة لتجميع الجهاز. (ب). القطب العاري وقنية التوجيه بالتفصيل. تتمثل الخطوة الأولى في إزالة (C) وإدخال (D) قنية التوجيه المعدنية من وإلى دميتها البلاستيكية عدة مرات لتسهيل إطلاقها بمجرد زرعها في رأس. الخطوة الثانية هي ثني قطب التسجيل الملتوي مرتين لمحاذاته مع قنية دليل غسيل الكلى (E ، F). (ز) يجب قطع طرف القطب الكهربائي ليكون أطول بمقدار 0.5 مم من طرف قنية التوجيه المعدنية. (ح) تحقق من دقة القطع باستخدام الفرجار الرقمي. بعد ذلك ، يجب استخدام دائرة السيليكون التي يبلغ طولها حوالي 1 مم لإصلاح محاذاة القطب الكهربائي لتوجيه قدم القنية (I). (ي) الصورة التي توضح كيفية رنين القطب الكهربائي وتوجيه عمود القنية. الخطوة الأخيرة هي وضع قطرة من الراتنج أو الغراء على قاعدة قنية التوجيه التي تثبت دائرة السيليكون عليها (K). (ل) جهاز مجمع جاهز للتعقيم.

الشكل 2. صور فوتوغرافية لأنواع مختلفة من أجهزة غسيل الكلى المجهري - مخطط كهربية الدماغ في الفئران المستخدمة (A) وصورة حامل مشبك المسبار (B) المستخدمة لزرع هذه الأجهزة. (أ) يتم استبدال قنية التوجيه (باللون الأخضر) بقنية غسيل الكلى المجهري عادة قبل 24 ساعة من التجربة. يسمح الموصل الكهربائي للجهاز (تم استخدام اليسار الأول للتسجيلات الموضحة في هذه المخطوطة) بتوصيل الأسلاك التي توصل الإشارة الكهربائية بمكبر الصوت ومعدات جمع البيانات. يتم توصيل الجهاز جراحيا بجمجمة الفئران المخدرة ويمكن الحصول على التسجيلات لاحقا دون التسبب في ألم أو إزعاج للفئران التي تتصرف بحرية.

الشكل 3. التصميم التجريبي. في الأسبوع السابق لتحريض حالة الصرع (SE) ، يتم زرع الفئران بالجهاز. يتم تحفيز SE بواسطة بيلوكاربين (إذا لم يتم تحللها وقتلها في 24 ساعة بعد SE ؛ الفئران من المجموعة الحادة) تتم مراقبتها بالفيديو لمدة 5 أيام (الخط الأزرق) ، ثم مراقبة مخطط كهربية الدماغ بالفيديو لتقييم تواتر النوبة ومدتها في أقفاص منازلهم (الخط الأخضر). بالنسبة لتجربة غسيل الكلى المجهري ، يتم نقل الفئران المصابة بالصرع وغير الصرع إلى مخطط كهربية الدماغ آخر تم إعداده بأقفاص أسطوانية في غضون 24 ساعة قبل جلسة غسيل الكلى المجهري ولا يزال مراقبا بالفيديو (الخط الأخضر الفاتح). تمثل الخطوط الحمراء العمودية جلسات غسيل الكلى في نقاط زمنية مختلفة لتطور مرض الصرع. تمثل الخطوط الحمراء الأفقية المجموعات المختلفة من المصابة بالصرع (غير المصابة بالصرع) ، حيث يشير السهم إلى اليوم الأخير من غسيل الكلى المجهري ويوم وفاة.