التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لمستحضرات جذع الدماغ والحبل الشوكي من القوارض حديثي الولادة

الملخص

المصدر: Rousseau, J., et al. الفيزيولوجيا الكهربية على مستحضرات جذع الدماغ والحبل الشوكي المعزولة من القوارض حديثي الولادة تسمح بتسجيل إخراج شبكة الجهاز التنفسي العصبي. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لمستحضرات جذع الدماغ والحبل الشوكي المعزولة من القوارض حديثي الولادة. يتم وضع المستحضر في غرفة التسجيل ، ويتم تسجيل رشقات الشهيق من جذع الدماغ في ظل ظروف مؤكسجة ومحرومة من الأكسجين باستخدام جذر العصب البطني الرابع في النخاع الشوكي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. الإعداد والتحضير

1. محاليل
   1. تحضير محاليل مخزون السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) وفقا للوصفات التالية. تتوفر وصفات أخرى ذات اختلافات تركيز في الأدبيات. قم بتخزين حلول المخزون في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
      1. محلول الملح: أضف 75.39 جم من كلوريد الصوديوم (129 ملي مولار نهائي) ؛ 2.5 جم من كلوريد الصوديوم (3.35 ملي مولار نهائي) ؛ 0.81 جم من NaH₂PO4 (0.58 ملي مولار نهائي) ؛ 2.33 جم من كلوريد_{المغنيسيوم 2} (1.15 ملي مولار نهائي) ؛ 1.85 جم من كلوريد الكالسيوم₂ (1.26 ملي مولار). يذوب في 800 مل من الماء المقطر ثم يملأ حتى 1 لتر بالماء المقطر.
      2. محلول البيكربونات: أضف 17.65 جم من NaHCO₃ (21 ملي مولار نهائيا). تذوب في 900 مل من الماء المقطر ثم تملأ إلى 1 لتر بالماء المقطر. ستؤدي الاختلافات في تركيز البيكربونات إلى اختلافات في الأس الهيدروجيني.
      3. محلول الجلوكوز: أضف 54.06 جم من الجلوكوز (30 ملي مولار نهائيا). يذوب في 400 مل من الماء المقطر ثم يملأ حتى 500 مل بالماء المقطر.
   2. تحضير aCSF عن طريق تخفيف 100 مل من محلول الملح ، و 100 مل من محلول البيكربونات ، و 50 مل من محلول الجلوكوز في 1 لتر من الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
   3. قم بإعداد قطب كهربائي زجاجي عن طريق تسخين الأنبوب الزجاجي وتمديده حتى ينكسر. قم برمل الطرف قبل الاستخدام. يمكن إعادة استخدام القطب الكهربائي عدة مرات طالما ظل نظيفا.
2. الإعداد التجريبي
   ملاحظه: يتم عرض تفاصيل الإعداد في الشكل 1.
   1. قم بتشغيل مكبر الصوت ، والمتوسط المتحرك ، ونظام الحصول على البيانات ، وجهاز التحكم في درجة الحرارة والمضخة. تحقق من تضخيم الإشارة (الكسب = 10,000) ، والترشيح (العتبة المنخفضة ، 10 هرتز ؛ عتبة عالية ، 5 كيلو هرتز) ، ومعدل أخذ العينات للتحويل التناظري إلى الرقمي للإشارة الأولية (2.5 كيلو هرتز).
   2. املأ زجاجة ب aCSF وافقاعها بالكربوجين (95٪ O₂ ، 5٪ CO₂). قم بتحفيز تدفق aCSF فقاعي ودافئ في غرفة التسجيل (الحجم 5 مل) بمعدل 4 مل / دقيقة. احتفظ بدرجة الحرارة في غرفة التسجيل عند 26 (± 1) درجة مئوية ، يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 في هذه الظروف القياسية.
   3. احتفظ ب 50 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) و aCSF فقاعات الكربوجين في حقنة سعة 50 مل بالقرب من حجرة التشريح.
   4. قم بتشغيل الكمبيوتر وابدأ تشغيل برنامج التسجيل.

2. تشريح

1. قم بوزن جنس وتحديده بصريا (الذكور لديهم مسافة أطول بين الأعضاء التناسلية ، بينما للإناث مسافة قصيرة من الأعضاء التناسلية ؛ غالبا ما تكون الأعضاء التناسلية الذكرية داكنة بينما تكون الأعضاء التناسلية الأنثوية وردية).
2. تخدير القوارض حديثي الولادة بأحد الخيارات التالية: التخدير بالتبريد (اغمر تماما في الثلج لمدة 4-5 دقائق) ، أو الحقن (إيكويتنسين بمعدل 4 مل / كجم) أو استنشاق التخدير المتطاير (الأيزوفلوران أو الأثير). تأكد من مستوى التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس انسحاب المخلب.
3. ضع على المقعد ، ووجهه البطني لأسفل. قسم الجزء المنقاري من الرأس إكليليا بمشرط على مستوى بريجما (يمكن رؤيته من خلال الجلد والجمجمة). قم بتنفيذ هذه الخطوة مباشرة بعد تخدير.
4. قسم الجسم بشكل تاجي بمشرط تحت الأعضاء الأمامية.
5. قم بإزالة الجلد والعضلات والأنسجة الدهنية واللزوجة باستخدام مقص وكماشة جراحية ورفيعة. نظرا لأن العظام ناعمة في هذا العمر ، فاحرص على عدم إتلاف الجهاز العصبي. قم بتنفيذ هذه الخطوة على مقاعد البدلاء.
6. ضع المستحضر في غرفة التشريح. استخدم aCSF المخزن في المحقنة لتزويد المستحضر بالأكسجين. من هذه النقطة إلى نهاية التسجيل ، استخدم المجهر.
7. على الوجه الظهري للمستحضر ، قم بقص الجمجمة والفقرات من المنقاري إلى الجزء الذيلي على طول المحور المتوسط بمقص وكماشة جراحية ورفيعة. افتح الجمجمة المقطوعة والفقرات لكشف الأنسجة العصبية. استخدم aCSF المخزن في المحقنة لتزويد المستحضر بالأكسجين.
8. باستخدام الكماشة ، قم بإزالة الغشاء العنكبوتية ، وهو نسيج رقيق يغطي سطح الأنسجة العصبية. احتفظ بالأم والأوعية الدموية ضد الأنسجة العصبية. استخدم aCSF المخزن في المحقنة لتزويد المستحضر بالأكسجين.
9. ضع المستحضر بحيث يكون وجهه الظهري لأسفل ، وقم بإسقاط جذع الدماغ والحبل الشوكي بعناية عن طريق قطع الأعصاب والأنسجة الضامة بالمقص أثناء تثبيت المستحضر في مكانه. النهج الظهري ممكن أيضا. حافظ على الجذور والأعصاب لأطول فترة ممكنة. قم بإزالة العظام لعزل جذع الدماغ والحبل الشوكي. استخدم aCSF المخزن في المحقنة لتزويد المستحضر بالأكسجين.
10. قم بإزالة المخيخ والهياكل المنقارية المتبقية عن طريق تقسيمها بالمشرط. استخدم aCSF المخزن في الإبرة لتزويد المستحضر بالأكسجين.
11. اختياريا اعتمادا على التصميم التجريبي ، قم بإزالة الجسر باستخدام المشرط بواسطة قسم إكليلي أمام الشريان المخيخي السفلي. لاحظ أن الاحتفاظ بالجسر بأكمله سيبطئ الإيقاع في الفئران ويمنعه تماما في الفئران. تظهر المستحضرات التي تتضمن فقط الجزء الذيلي من الجسر نشاطا شبيها بالجهاز التنفسي بتردد ثابت عند جذر C4.

3. التسجيل

1. ضع المستحضر في غرفة التسجيل ، ووجهه البطني لأعلى. قم بإصلاح المستحضر باستخدام دبابيس في الجزء السفلي من الحبل الشوكي والجزء الأكبر من جذع الدماغ.
2. باستخدام حقنة مرتبطة بالقطب الكهربائي بإبرتها ، قم بإحداث انخفاض في القطب الكهربائي (قطر الطرف الزجاجي: 150 - 225 ميكرومتر) عن طريق سحب مكبس المحقنة ، من أجل ملء القطب جزئيا باستخدام aCSF.
3. باستخدام معالج دقيق ، ضع القطب الكهربائي بحذر بالقرب من أحد الجذور البطنية الرابعة. يمكن أن تقدم الجذور البطنية الأخرى أيضا نشاطا شبيها بالجهاز التنفسي (على سبيل المثال ، العصب القحفي الثاني عشر ، الجذر البطني C1).
4. إحداث انخفاض في خزان القطب الكهربائي عبر المحقنة عن طريق سحب المكبس لشفط جذر العصب برفق. ثم حرك القطب بعناية لتطبيقه على الحبل الشوكي.
   ملاحظه: من الناحية المثالية ، يتطابق حجم الجذر مع حجم فتحة القطب الكهربائي ، وبالتالي يخلق ختما بين المقصورات الداخلية والخارجية للقطب. نظرا لأن مكبرات الصوت التفاضلية شائعة الاستخدام لمثل هذه التسجيلات ، فإن أي فتحة بين داخل القطب وغرفة التسجيل تقلل من جودة الإشارة وتجعل من الصعب التخلص من ضوضاء الخلفية.
5. ابدأ التسجيل.
6. سجل الإيقاع الناتج عن المستحضر في ظل الظروف الطبيعية (على سبيل المثال ، aCSF فقاعات مع الكربوجين: 95٪ O₂ و 5٪ CO₂) لمدة 20 دقيقة على الأقل لتحديد معلمات خط الأساس للمستحضر.
7. قم بتبديل التروية من aCSF الفقاعي بالكربوجين إلى التحفيز aCSF (أي فقاعات مع 95٪ N₂ و 5٪ CO₂ لتحفيز نقص الأكسجة) لمدة 15 دقيقة. سجل مدة التعرض في ورقة بيانات التسجيل. استخدم أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ بين زجاجة aCSF والغرفة كلما أمكن ذلك لتجنب انتشار الغاز إلى الخارج من الأنبوب.
8. قم بتبديل التروية مرة أخرى إلى aCSF القياسي الملزوج بالكربوجين لمدة 15 دقيقة على الأقل لتسجيل الاسترداد. سجل هذا في التسجيل وورقة بيانات.
9. قم بإنهاء التسجيل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. مخطط ملخص للإعداد.يتم تسخين aCSF الفقاعي وإرساله بواسطة مضخة في غرفة التسجيل. يتم شفط فائض aCSF في غرفة التسجيل بواسطة مضخة والتخلص منه. ترتبط غرفة التسجيل بالأرض وجهاز التحكم في درجة الحرارة. يتم نقل إخراج القطب مباشرة إلى مكبر الصوت ، ثم إلى المتوسط المتحرك ونظام الحصول على البيانات ، وأخيرا الكمبيوتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سيلجارد سيجما ألدريتش 761036-5EA استخدم تحت الغطاء كلوريد الصوديوم بيوشوب SOD002 كيه سي إل بيوشوب بوك 888 كلوريد_{الهواء 2} بيوشوب سي سي إل 444 مغنكلوريد₂ بيوشوب ماج510 NaHCO₃ بيوشوب سوب999 NaH₂PO₄ بيوشوب SPM306 د-الجلوكوز بيوشوب GLU501 كربوجين ليندي 343-02-0006 تحكم في درجة الحرارة وارنر إنسترومنتس، هامدن، كونيتيكت، الولايات المتحدة الأمريكية تي سي -324 ب قطب الشفط أنظمة AM ، إيفريت ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية نموذج 573000 مضخم التيار المتردد التفاضلي أنظمة AM ، إيفريت ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية نموذج 1700 المتوسط المتحرك CWE ، أردمور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية نموذج MA-821 نظام الحصول على البيانات Dataq Instruments ، أكرون ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية الموديل DI-720 برنامج LabChart ADInstruments ، كولورادو سبرينغز ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكية برامج المنشور Graphpad ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية غرفة التسجيل صنع منزلي قاعدة كانيتيك ، بنسنفيل ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية معالج دقيق شركة World Precision Instrument Inc ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية ميغابايت قاعدة كانيتيك ، بنسنفيل ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية كيت-آر مضخة تمعجية جيلسون ، ميدلتون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية ميغابايت قفص فاراداي صنع منزلي مينيبولس 3 حاسوب