توليد تذبذبات جاما المحلية Cornu Ammonis 1 (CA1) باستخدام محفزات الكزاز في شريحة دماغ الحصين

الملخص

المصدر: هاتش ، آر جيه ، وآخرون. توليد التذبذبات γ الكالسييوم المحلي عن طريق تحفيز الكزاز. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو إجراء إحداث تذبذبات جاما CA1 المحلية في شريحة دماغ الفأر في الحصين CA1 باستخدام محاكاة الكزاز. هذه الطريقة مهمة لفهم نشاط الشبكة العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الإعداد لقطع شرائح الدماغ

1. تحضير محلول قطع يتكون من (ملليمتر) 125 كولين كلوريد ، 2.5 كيلولولار ، 0.4 كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 6 ملغ كلوريد₂ ، 1.25 هيدروكسيد_{هيدروكسيد هيدروكسيد 2}PO₄ ، 26 NaHCO₃ ، 20 D-glucose مشبع بغاز الكربوجين (95٪ O_2-5٪ CO₂) ومحلول تسجيل السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) يتكون من (ملليمتر) 125 كلوريد الصوديوم ، 2.5 كيلوكلوريد ، 2 كلوريد_{المكالسيوم 2} ، 2 ملجمكلوريد₂ ، 1.25 هيدروجين_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 26 NaHCO₃ ، 10 D-glucose ، مشبع بالكربوجين. ضع محلول القطع على الثلج لإبقائه باردا.
2. قم بتجميد ما يقرب من 400 مل من محلول التقطيع واخلطه مع 100 مل من محلول القطع غير المجمد لعمل ملاط ثلج. فقاعة مع الكربوجين (95٪ O_2-5٪ CO₂) بتدفق حوالي 0.5 لتر / دقيقة من خلال أنابيب من العيار الصغير أو الزجاج الملبد لإنتاج تدفق ثابت ولكن لطيف للفقاعات.
3. قم بإعداد دورق سعة 250 مل مع ملحق شبكي مرتفع من النايلون توضع عليه شرائح الدماغ. املأ ب aCSF لتغطية الشبكة بحوالي 2 سم وفقاعات بالكربوجين ، مما يضمن أن الفقاعات لا تعطل منطقة تثبيت الشريحة بشكل مباشر. من المهم أيضا عدم وجود فقاعات هواء في شبكة النايلون ، لذلك في حالة وجود أي منها ، قم بإزالتها. ستكون هذه هي غرفة الاحتجاز ويتم الاحتفاظ بها عند RT (20 - 25 درجة مئوية).
4. قم بتخطيط أدوات التشريح بما في ذلك مقص كبير ، ومقص صغير ، وملاعق صغيرة وكبيرة ، وأزواج كبيرة وصغيرة من الملقط وقم بتبريدها على الجليد. ضع كتلة قطع الأنسجة الاهتزازية على الثلج على مربع من رقائق الألومنيوم. احصل على قطعتين من ورق الترشيح 6 سم ، وشفرة حلاقة أحادية الحافة ، ودورق 25 مل مملوء بملاط محلول القطع أيضا.
5. املأ وعاءا ثانيا بالثلج ، وضع قطعة من المناديل الورقية على الثلج وضع طبق ثقافة 12 سم فوقها. املأ طبق الثقافة بمحلول القطع وملاط الثلج وفقاعات بالكربوجين. هذه هي الحاوية التي يتم فيها تشريح الدماغ.
6. تحضير الاهتزاز. قم بإزالة شفرة حلاقة جديدة ذات حدين (استخدم شفرة جديدة في كل مرة) من غلافها ورشها بنسبة 80٪ من الإيثانول ثم الماء منزوع الأيونات. قم بقص ماصة نقل بلاستيكية سعة 3 مل عند النقطة التي تبدأ فيها في الاستدقاق. سيتم استخدام هذا لنقل شرائح الدماغ. ثني إبرة 27 جم في القاعدة بحوالي 45 درجة وقم بتوصيلها بحقنة 1 مل. سيتم استخدام هذا لمعالجة الشرائح أثناء القطع.

< ص الفئة = "jove_title" >2. قطع شرائح الدماغ

1. تخدير الفأر (P16-P18) باستخدام 2٪ إيزوفلوران أو طريقة معتمدة محليا. بعد الحث ، اقطع رأس بمقص كبير وأسقط رأسه في طبق الثقافة مقاس 12 سم الذي يحتوي على ملاط محلول القطع الفقاعي. يجب أن يغمر الملاط الرأس تماما للتبريد السريع.
2. أمسك الجزء الأمامي من الرأس بيد واحدة لتقشير الجلد والأنسجة الضامة للأمام نحو الأنف. باستخدام المقص الصغير ، قم بقص النسيج الضام للكشف عن الجمجمة الأساسية. ثم قم بإزالة العضلات التي تغطي الجانب الظهري للجمجمة والرقبة.
3. قم بإزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق تثبيت الجزء الأمامي من الجمجمة أولا بالملقط الكبير ثم قم بعمل قطعتين جانبيتين عبر العظم على جانبي الثقبة باستخدام المقص الصغير (الشكل 1 ، التخفيضات المسماة A1 و A2).
   1. قم بعمل قطع آخر بين العينين (الجزء الأمامي من البريجما مباشرة) (الشكل 1 ، القطع المسمى ب) ثم قم بقصه بعناية على طول الخيط السهمي الأمامي ويعكس أقسام الجمجمة المقطوعة للكشف عن الدماغ (الشكل 1 ، القطع المسمى C).
   2. استخدم الملعقة الصغيرة لاستخراج الدماغ ووضعها على طبق ثقافة. كن على دراية بالأعصاب القحفية الموجودة في الجانب السفلي من الدماغ والتي ستحتاج إلى قطعها ، ويمكن القيام بذلك باستخدام ملعقة صغيرة أصغر حجما. باستخدام الملعقة الأكبر ، انقل الدماغ إلى دورق سعة 25 مل مملوء بملاط محلول القطع.
4. تحضير نصف الكرة المخية للتقطيع.
   1. ضع قطعة واحدة من ورق الترشيح مقاس 6 سم في قاع طبق ثقافة طازج ثم املأها بمحلول التقطيع الطازج والفقاعات. استخدم الملعقة الأكبر لوضع الدماغ ، الجانب البطني لأسفل ، على ورق الترشيح. خذ شفرة حلاقة أحادية الحافة جديدة ونظيفة واقطع الدماغ لإزالة المخيخ ، ثم قم بعمل قطع على طول خط الوسط لفصل الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية.
5. تحضير كتلة الأنسجة الاهتزازية.
   1. خذ كتلة الأنسجة الاهتزازية المبردة ، وجفف السطح ، وضع قطرة من غراء cyanoacrylate في المنتصف ، وانتشر بالتساوي إلى الحجم التقريبي للدماغ. استخدم الملعقة الصغيرة للتلاعب بأحد نصفي الكرة المخية على الملعقة الدقيقة الكبيرة بحيث يكون الجانب الإنسي من الدماغ لأسفل.
   2. المس حافة الملعقة الموجودة في واجهة الدماغ على القطعة الثانية من ورق الترشيح لإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول. حرك الدماغ من الملعقة الأكبر باستخدام الملعقة الأصغر لتوجيهه إلى الغراء.
   3. قم بتأمين كتلة القطع في غرفة الاهتزاز واملأ الغرفة بملاط محلول القطع والفقاعات ، مما يضمن انغماس الدماغ تماما. قم بتدوير كتلة القطع بحيث يكون الجانب البطني من الدماغ مواجها للشفرة.
6. تقطيع الدماغ.
   ملاحظه: كل اهتزاز فريد من نوعه ، لذا اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
   1. اضبط سمك الشريحة على 450 ميكرومتر ، وتأكد من اهتزاز الشفرة أثناء تحركها عبر الدماغ بسرعة 0.3 مم / ثانية تقريبا. سيتم إنتاج الشرائح بشكل جانبي إلى وسطي وعادة ما يمكن قطع 3-4 شرائح من كل نصف كرة كرية.
   2. إذا رفعت قاعدة الشريحة ، فاستخدم الإبرة المنحنية 27 جم للضغط برفق على الشريحة لأسفل. عند قطع كل شريحة، استخدم ماصة النقل لنقلها إلى المنصة في غرفة التثبيت حيث تكون قابلة للحياة لمدة تصل إلى 8 ساعات.

< p class = "jove_title" >3. تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية

1. تركيب الشريحة في غرفة التسجيل.
   1. باستخدام ماصة النقل ، ضع شريحة دماغية في غرفة تسجيل مغمورة مع تدفق aCSF بسرعة 1 - 2 مل / دقيقة وتسخينها إلى 32 درجة مئوية. يختلف aCSF المستخدم في التسجيلات عن ذلك الموجود في غرفة الاحتجاز حيث يزداد تركيز Mg²⁺ من 2 ملي مولار إلى 4 مللي مولار.
   2. قم بتأمين الشريحة ب "قيثارة" (فولاذ مقاوم للصدأ نصف دائري مع خيوط نايلون ممتدة بمسافة 2-3 مم). ضع القيثارة بحيث تعمل الخيوط بالتوازي مع CA1. زيادة سرعة التروية إلى 8 - 10 مل / دقيقة عند 32 درجة مئوية.
2. تحت مجهر تشريح ، ضع قطبا كهربائيا محفزا وقطبا كهربائيا للتسجيل (قطب زجاجي مملوء بمحلول تسجيل aCSF) على سطح الطبقة الرادياتومية ل CA1 (الشكل 2 أ). ضع القطب المحفز أولا، ثم ضع قطب التسجيل.
3. تحفيز ضمانات شافر بسعة 120 - 150 ميكرو أمبير ونبض اختبار لمدة 0.1 مللي ثانية ومراقبة شكل موجة الجهد المثير بعد التشابك الناتج (fEPSP) لتحديد صحة الشريحة (الشكل 2 ب). قد تحتاج الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل إلى نقلها إلى الشريحة على بعد حوالي 50-100 ميكرومتر من سطح الشريحة للحصول على تسجيل fEPSP بوابل ألياف صغير وسعة كبيرة. تعتبر fEPSPs المستحثة من Schaffer النمطية وتوفر مؤشرا جيدا على صحة الشريحة. تظهر الشرائح الصحية عادة نسبة سعة من الألياف إلى fEPSP أقل من 0.3.
4. إعادة وضع الأقطاب الكهربائية.
   1. باستخدام مجهر تشريح ، انقل القطب المحفز إلى منتصف الطبقة oriens وانقل قطب التسجيل إلى طبقة الخلية الهرمية بالقرب من قطب التسجيل قدر الإمكان ، كما هو موضح في الشكل 3 أ. قد تحتاج الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل إلى دفعها إلى الشريحة حوالي 50 - 100 ميكرومتر بحيث تكون سعة استجابة fEPSP إلى نبضة الاختبار 120 - 150 ميكرو أمبير حوالي 1 مللي فولت.
5. توليد تذبذبات γ.
   1. لتوليد تذبذبات γ ، قم بتحفيز الأنسجة بقطار من نبضات 20 × 0.1 مللي ثانية يتم تسليمها عند 200 هرتز. يمكن أن ينتج عن هذا الحافز الكزازي استجابات قابلة للتكرار عند تسليمه كل 5 دقائق.
6. استخدم معلمات التسجيل التالية.
   1. قم بقياس كسب إشارة الخرج لتتناسب مع نطاق جهد الدخل للمحول التناظري إلى الرقمي. تأكد من أن الحد الأقصى المتوقع لرحلة الإشارة يستخدم ما لا يقل عن 30٪ من نطاق جهد الإدخال. كن حذرا عند تعيين مكاسب عالية جدا ، حيث قد تقطع الإشارات. عرض النطاق الترددي النموذجي المطلوب للتسجيلات الميدانية هو 500 هرتز مع اقتران التيار المتردد عند 0.1 هرتز لإزالة انحراف خط الأساس.
   2. قم برقمنة ما لا يقل عن 4-5 مرات أسرع من تردد الزاوية لمرشح التمرير المنخفض لتجنب تعرج الإشارة.

النتائج

الشكل 1. تخطيطي للجمجمة والجلد المغطى يوضح موقع الجروح للكشف عن الدماغ. تحدد A1 و A2 و B و C مواقع الجروح التي يجب إجراؤها لفتح الجمجمة لإزالة الدماغ.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. وضع الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل في ضمانات CA1 Schaffer لاختبار صحة الشريحة

المواد