التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية من ذبابة الفاكهة Sensilla استجابة للروائح المتطايرة

الملخص

المصدر: Ng، R.، et al. التسجيل الفيزيولوجي الكهربي من ذبابة الفاكهة Trichoid sensilla استجابة للروائح ذات التقلب المنخفض. J. Vis. Exp. (2017).

في هذا الفيديو ، يتم تركيب ذبابة الفاكهة الحية في أنبوب لإجراء دراسات الفيزيولوجيا الكهربية. يتم وضع الأقطاب الكهربائية في قاعدة الحس لتسجيل استجابات عصبية محددة للفيرومونات باستخدام الخلايا العصبية المستقبلة الشمية للذبابة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الأجهزة للتسجيل at4

1. استخدم أداة سحب الماصة لتحضير أقطاب كهربائية بشعيرات دموية زجاجية من سيليكات الألومنيوم (OD 1.0 مم، معرف 0.64 مم). قم بتخفيف طرف القطب المرجعي قليلا باستخدام زوج من الملقط الدقيق لتسهيل الإدخال في كليبيوس الذبابة (أي صفيحة مستديرة في مقدمة رأس الذبابة ، فوق أجزاء الفم).
   ملاحظة: تم استخدام ذكور WT (النوع البري) البالغ من العمر 7 أيام (برلين) في هذه الدراسة. استخدم محلول ملحي AHL كإلكتروليت لكلا القطبين.
2. تحضير 1 لتر من AHL (شبيه بالهيموليمفاد البالغ) عن طريق خلط 900 مل من الماء المقطر مع 6.312 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.373 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.337 جم من NaHCO₃ ، 0.1120 جم من NaH₂PO₄ ، 1.892 جم من Trehalose -2H₂O ، 3.423 جم من السكروز ، 1.192 جم من HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) ، و 8.2 مل من 1M MgCl₂. باستخدام الماء المقطر ، ارفع الحجم الإجمالي إلى 1 لتر ، ارفع الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم وقم بتعقيم المحلول باستخدام نظام ترشيح يعمل بالتفريغ. للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بحصص AHL عند 4 درجات مئوية
   ملاحظة: تتوقف عمليات التسليم المتسقة لحمض البالميتوليك على التوحيد بين الخراطيش. يجب تجميع كل خرطوشة بطريقة قابلة للتكرار.
3. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة 0.9 سم من طرف طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإنشاء قسم الخرطوشة الأول ، بقياس 4.1 سم ؛ راجع الأبعاد المفصلة في الشكل 1 أ. استخدم طرف ماصة آخر سعة 200 ميكرولتر وقم بإزالة 1.7 سم و 1.5 سم من الطرف والقاعدة لإنشاء قسم الخرطوشة الثاني ، قياس 1.8 سم (الشكل 1 أ). استخدم مسطرة لضمان قابلية التكرار.
4. استخدم أداة ثقب 1/8 بوصة لقص الأقراص من ورق الترشيح.
5. استخدم ملقطا لوضع قرص ورق ترشيح عند طرف قسم الخرطوشة الثاني. تأكد بصريا من وجود فتحة في طرف الخرطوشة يمكن أن يمر من خلالها الهواء.
6. قم بتوصيل قسمي الخرطوشة الأول والثاني ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. قم بتوجيه قسم الخرطوشة الثاني لأسفل لتسهيل التصويب المربع في الإعداد (الشكل 1 ب).
7. قم بتوصيل الخرطوشة بأنبوب توصيل الرائحة المثبت على معالج دقيق.
   ملاحظة: يسمح هذا التصميم بتدوير الخرطوشة للخارج لتسهيل التبادل (الشكل 1C).
8. اضبط تدفق الهواء المرطب المستمر على 2 لتر / دقيقة في وحدة تحكم كتلة واحدة وتدفق الرائحة إلى 500 مل / دقيقة في وحدة تحكم كتلة أخرى.
9. باستخدام البرنامج (انظر جدول المواد) ، قم ببرمجة الإجراء لإدارة نفخة رائحة 500 مللي ثانية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير محاليل رائحة حمض البالمتوليك للتسليم

ملاحظة: تستجيب Or47b ORNs لكل من رابطة الدول المستقلة وحمض البالميتوليك. نظرا لأن حمض البالمتوليك غير مستقر في RT ، يتم تخزين المخزونات عند -20 درجة مئوية واستخدامها في غضون شهر عند الفتح. الإيثانول هو المذيب المفضل لحمض البالمتوليك.

1. استخدم خلاط دوامة لخلط 10 ميكرولتر من مخزون أو مخففات حمض رابطة الدول المستقلة أو العابرة بالميتوليك مع 90 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ للتخفيفات التسلسلية بمقدار عشرة أضعاف في الأنابيب الدقيقة سعة 1.7 مل. قم بإعداد مخففات حمض البالمتوليك الطازجة يوميا قبل التجارب واستخدمها في غضون يوم.
   ملاحظة: يوصى باستخدام قارورة زجاجية للروائح غير القابلة للذوبان في الإيثانول لتحضير تخفيفات الرائحة مع أنواع أخرى من المذيبات العضوية.
2. باستخدام ماصة دقيقة P10، ضع 5 ميكرولتر من محاليل حمض البالميتوليك المستقلة من التخفيفات المرغوبة على ورق الترشيح في كل خرطوشة مقابلة.
   ملاحظة: تحتوي الجرعة الأعلى (^10-1) على 450 ميكروغرام من المركب. بالنسبة لمحاليل حمض البالميتوليك المتحولة ، ضع 4.5 ميكرولتر بدلا من ذلك بحيث تحتوي الجرعة الأعلى (^10-1) على 450 ميكروغرام من المركب.
3. ضع خراطيش حمض البالمتوليك في مجفف فراغ لمدة ساعة واحدة عند RT و 7.59 مم زئبق من الضغط لتبخير المذيب تماما.
   ملاحظة: يمكن استخدام الخراطيش لمدة تصل إلى 4 ساعات في RT.

< p class = "jove_title" >3. تحضير ذبابة الفاكهة للوصول السهل إلى at4 Sensilla للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في الجسم الحي

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم تربية الذباب WT (برلين) في وسط دقيق الذرة القياسي عند 25 درجة مئوية في دورة 12:12 فاتحة ومظلمة. عند الإغلاق ، يتم فصل الذباب حسب الجنس إلى مجموعات من عشرة ، حيث يتم إيواؤهم جماعيا حتى 7 د من العمر. تستجيب Or47b ORNs (الخلايا العصبية المستقبلة الشمي) في كل من الذباب من الذكور والإناث لحمض البالمتوليك. من أجل البساطة ، يتم فحص ذكور الذباب فقط في الدراسة الحالية.

1. قم بتجميع شريحة إعداد الذبابة: على شريحة زجاجية ، ضع غطاء زجاجي (18 × 18 مم 2) على كمية صغيرة من طين النمذجة ، لتشكيل زاوية ~ 3 درجات مع الشريحة الزجاجية. ضع شريطا على الوجهين على الحافة الداخلية للغطاء ومنطقة الشريحة أدناه مباشرة. استبدل بشريط لاصق جديد لكل يوم من أيام التسجيل (الشكل 2 أ).
2. استخدم شفاط الذباب15 لجمع الذبابة التي تهمك الأنبوب ثم ضع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر على نهاية الأنبوب. في الوقت نفسه، قم بتحريك الأنبوب للأمام أثناء نفخ الهواء فيه لدفع الذبابة إلى نهاية طرف الماصة. استخدم شفرة حلاقة لقطع أسفل جسم الذبابة مباشرة وأطوال 2 رأسين فوق الذبابة.
قم
3. بدك الجزء السفلي من طرف الماصة بطين النمذجة ، وادفع الذبابة لأعلى حتى يتم الكشف عن كل من الهوائيات والكليبيوس (الشكل 2 ب). لتجنب قتل الذبابة ، أضف ما يكفي من الطين فقط لفضح الهوائيات والأريستا ، لأن هذا يمنع بطن الذبابة من التكسير. علاوة على ذلك ، أضف الطين ببطء وبرفق لمنع أي انقباض مفاجئ. تأكد من أن الذبابة على قيد الحياة عن طريق التحقق من حركة الهوائيات أو خرطوم.
4. استخدم الملقط لمناورة طرف الماصة الذي يضم الذبابة. قم بتوجيه الرأس بحيث يواجه clypeus يمين المراقب. اضبط الإعداد على طول الغطاء باستخدام ملقط دقيق حتى يقع الجانب الجانبي للهوائي على سطح الغطاء المسجل (الشكل 2 ب).
5. ضع قضيب تثبيت على الأريستا لتثبيت الهوائي بالشريط على الوجهين لمنع الحركة (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: يتم سحب قضيب التثبيت من شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة ويتم تثبيته في موضعه مع طين النمذجة (الشكل 2 أ).
6. ضع الإعداد على مرحلة الحفارة (الشكل 2 ج). باستخدام المجهر ، تأكد من أن المثلث الصبغي مرئي على طول الحافة البعيدة الجانبية للجزء الثالث من الهوائي.
   ملاحظة: يجب أن تكون الحساسة مظللة على الخلفية ، مما يبسط تحديدها ويسهل التسجيل (الشكل 3). في هذا المستحضر ، تكون أكثر أنواع trichoid التي يمكن الوصول إليها من نوع at4.
7. كما هو موضح سابقا ، 2 ، 15 ، حافظ على الإعداد تحت تدفق هواء مرطب ثابت (2 لتر / دقيقة) يتم توصيله عبر أنبوب توصيل هواء منفصل على بعد حوالي 2 سم من الإعداد (الشكل 4).

فئة

4. تسجيل نشاط at4 Sensillum من Or47b ORNs في at4 Trichoids استجابة لحمض البالميتوليك

1. أدخل القطب المرجعي في clypeus (الشكل 3 أ). بحركة سريعة وسلسة، تأكد من إدخال القطب الكهربائي أسفل السطح مباشرة، حيث يمكنه ملامسة الهيموليمف أسفل البشرة لتجنب تلف الأنسجة.
2. اخفض قطب التسجيل ببطء حتى يدخل نفس مستوى العرض مثل حساس الهدف (الشكل 3 ب). سجل تحت عدسة موضوعية 50X.
   ملاحظه: تتطلب بشرة ثلاثية القشرة الصلبة إدخال قطب التسجيل في القاعدة الحسية ، التي توفر مساحتها الأوسع هدفا أكبر يقلل من احتمالية انحراف القطب بعيدا (الشكل 3 ب ، داخلي).
3. قبل تطبيق محفزات الرائحة على sensillum ، لاحظ معايير الاختيار التالية: يجب رفض أي trichoid يفشل في تلبية هذه المعايير ، ويجب اختيار حس آخر بدلا من ذلك.
   1. لاحظ نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (انظر الشكل 3C للحصول على مثال).
   2. لاحظ طفرات يمكن تحديدها من الخلايا العصبية at4A و at4C (الشكل 3C).
      ملاحظة: يبدو سعة السنبلة at4B مشابهة جدا ل at4A10 ولا يمكن التعرف عليها بسهولة بدون تحفيز الرائحة.
   3. لاحظ أن معدل إطلاق النار القاعدي للخلايا العصبية at4A حوالي أو أقل من 20 هرتز.
      ملاحظة: هذا المعيار خاص ب at4A لأن معدل إطلاق النار القاعدي للخلايا العصبية أعلى من معدل ORNs الأساسي. يشير إطلاق النار القاعدي الأعلى بكثير إلى أن الخلايا العصبية ربما تكون قد تضررت أثناء إدخال القطب.
4. قم بتوصيل الخرطوشة بأنبوب توصيل الرائحة. ابدأ بالتحكم في المذيبات ثم الروائح ، من تركيزات منخفضة إلى عالية. استخدم المعالج الدقيق لمناورة الخرطوشة باتجاه الإعداد أثناء توجيه الخرطوشة بشكل مباشر إلى رأس الإعدادية. تأكد بصريا من أن الخرطوشة موجهة مباشرة إلى الهوائي (الشكل 4) من على بعد بضعة ملليمترات.
   ملاحظة: الهدف هو توجيه فتحة الخرطوشة مباشرة إلى الهوائي ووضعها بالقرب من الأنسجة المستهدفة.
5. تأكد من فصل خرطوشة الرائحة عن قطب التسجيل الموجود على يمينها بمقدار 1 - 2 مم ومن شريحة إعداد الذبابة أدناه بمقدار 1 مم ><تقريبا. ملاحظه: في الإعداد الموضح هنا ، يحد خرطوشة الرائحة بشكل وثيق قطب التسجيل والقطب المرجعي وشريحة إعداد الذبابة (الشكل 4).
   ملاحظة: ضع في اعتبارك المسافة بين الخرطوشة وأقطاب التسجيل/المرجعية. يوصى بمسافة حوالي 4 مم. قد يؤدي الاتصال غير المقصود إلى إنهاء الإشارة وكسر طرف قطب التسجيل ، مما يؤدي إلى إتلاف الخلايا العصبية الحالية وتعقيد المزيد من التسجيلات.
   ملاحظة: ضع في اعتبارك المسافة التي تفصل بين الخرطوشة وشريحة إعداد الذبابة. قد يؤدي لمس الغطاء أيضا إلى إزاحة قطب التسجيل ، مما يؤدي إلى تعطيل التسجيل.
6. اضغط على "تسجيل" في برنامج الحصول على البيانات لبدء التسجيل.
   ملاحظة: لكل تسجيل 10 ثوان، يتم توصيل نبضة رائحة واحدة مقدارها مللي ثانية 500 مباشرة إلى الهوائي، كما هو موضح في الخطوة 9.1.
7. بعد وضع الرائحة ، اسحب الخرطوشة بعناية قبل استبدالها بخرطوشة ثانية أعلى تركيز. استمر حتى يتم الحصول على نطاق الجرعة بالكامل.
   ملاحظة: يوصى بتسجيل Or47b ORN واحد فقط من كل ذبابة لتجنب أي آثار محتملة للتكيف.
8. اشطف قطب التسجيل جيدا بالماء المقطر بعد الانتهاء من التسجيل لهذا اليوم.
9. تحليل البيانات ورسمها باستخدام برنامج التحليل غير المتصل بالإنترنت المتاح تجاريا.

النتائج

الشكل 1: إعداد الخرطوشة ومقياس العطرة. (أ) تحضير خراطيش الرائحة. من اليسار إلى اليمين: طرف ماصة قياسي سعة 200 ميكرولتر، وقسمي الخرطوشة الأول والثاني، وخرطوشة رائحة مكتملة. (ب) الخرطوشة المتصلة بمقياس الشم ، مما يدل على الزاوية الهابطة للقسم الثاني. (ج) إعداد مقياس الرائحة الذي يصور أنبوب توصيل الرائحة المثبت على جهاز المعالجة الدقيقة ، مع خرطوشة رائحة متصلة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الإعداد الإعدادي والمواد المتنوعة أداة مجتذب الماصة أدوات سوتر ، نوفاتو كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية ص 97 مجتذب الماصة الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات الأدوات الدقيقة العالمية ، ساراسوتا فلوريدا الولايات المتحدة الأمريكية 1ب 100 إف -4 لجعل قضبان القابضة الشعيرات الدموية الزجاجية من سيليكات الألومنيوم أدوات سوتر ، نوفاتو كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية AF100-64-10 لصنع أقطاب كهربائية شرائح مجهر Superfrost فيشر ساينتفيك ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 12-550-143 لمحطة الطيران الإعدادية شريط دائم مزدوج الوجهين سكوتش سانت بول مينيسوتا الولايات المتحدة الأمريكية غير أ لمحطة الطيران الإعدادية مجهر عمودي أوليمبوس ، شينجوكو طوكيو اليابان BX51 لجهاز التسجيل طين النمذجة Plastalina فان أكين ، شمال تشارلستون ساوث كارولينا الأمريكية B0019QZMQQ لمحطة الإعداد وتثبيت قضيب القابضة وحدة فلتر معقمة سريعة التدفق يمكن التخلص منها مع غشاء SFCA ، 0.45 مم نالجين، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية # 156-4045 لتعقيم محلول AHL طرف ماصة 200 ميكرولتر VWR رادنور ، بنسلفانيا الولايات المتحدة الأمريكية 53508-810 لصنع خراطيش الرائحة وإعداد الذباب ورق الترشيح واتمان ، ميدستون كينت المملكة المتحدة 740-[إ] لصنع خراطيش الرائحة مجفف الفراغ كول بارمر ، فيرنون هيلز ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية VX-06514-30 لتبخير مذيب الإيثانول حمض البالمتوليك الرابطة كايمان للكيماويات ، آن أربور ميشيغان الولايات المتحدة الأمريكية # 10009871 (CAS # 373-49-9) رائحة Or47b حمض البالميتوليك عبر كايمان للكيماويات ، آن أربور ميشيغان الولايات المتحدة الأمريكية # 9001798 (CAS # 10030-73-6) رائحة Or47b ايثانول الطيف الكيميائي MFG. نيو برونزويك نيوجيرسي الولايات المتحدة الأمريكية E1028-500MLGL لتخفيف حمض البالميتوليك خرطوشة الرائحة Micromanipulator Siskiyou ، Grants Pass أو الولايات المتحدة الأمريكية MX130R لوضع مقياس الرائحة برنامج Flow Vision أليكات ، توسكون أريزونا الولايات المتحدة الأمريكية فلوفيجنسك برنامج للتحكم في معدل التدفق تحكم الكتلة أليكات ، توسكون أريزونا الولايات المتحدة الأمريكية MC-2SLPM-D للتحكم في معدل تدفق الهواء المرطب تحكم الكتلة أليكات ، توسكون أريزونا الولايات المتحدة الأمريكية MC-500SCCM-D للتحكم في معدل التدفق لتحفيز الرائحة كلامبكس الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale CA الولايات المتحدة الأمريكية الإصدار 10-4 برنامج الحصول على البيانات أنبوب توصيل الهواء ايس جلاس ، فينلاند نيوجيرسي الولايات المتحدة الأمريكية 8802-936 لتوصيل هواء مرطب عدسة موضوعية 50X أوليمبوس ، شينجوكو طوكيو اليابان LMPLFL50X جهاز التسجيل Clampfit 10 الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale CA الولايات المتحدة الأمريكية الإصدار 10-4 برنامج لتحليل سبايك إيغور برو 6 WaveMetrics أو بحيرة أوسويغو أو الولايات المتحدة الأمريكية الإصدار 6-37 برنامج لتحليل البيانات مراقب الصوت ALA للأدوات العلمية ، فارمينغديل نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية NPIEXB-AUDIS-08B تقارير سمعية عن الارتفاعات الفردية مكبر للصوت خارج الخلية ALA للأدوات العلمية ، فارمينغديل نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية NPIEXT-02F لزيادة سعة الإشارات الكهربائية تحكم الصمام وارنر إنسترومنتس [فك-8] للتحكم في فتح الصمام لتحفيز الرائحة تسجيل القطب الكهربائي Micromanipulator أدوات سوتر ، نوفاتو كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية النائب 285 لوضع قطب التسجيل مكبر للصوت Headstage ALA للأدوات العلمية ، فارمينغديل نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية مكافئه-16.0008 لزيادة سعة الإشارات الكهربائية الذبذبات تكترونيكس أو بيفرتون أو الولايات المتحدة الأمريكية TDS2000C تقرير مرئي عن المسامير الفردية